دوره 30، شماره 188: هفته دوم تیر ماه 1391

شناسایی مارکر درون سلولی سیتوکراتین 18 به وسیله‌ی فلوسایتومتری در سلول‌های نکلئوس پالپوزوس دیسک بین مهره‌ای انسانی و مقایسه‌ی توان تکثیر و مورفولوژی این سلول‌ها در داربست‌های بیوپلیمری آلژینات و کیتوسان-ژلاتین

مسعود قربانی, بتول ‌هاشمی‌بنی, حمید بهرامیان, زینب کریمی, سعید زمانی, سید احمد میرحسینی, سید حمید زرکش اصفهانی

چکیده


مقدمه: دژنره شدن دیسک بین مهره‌ای در اثر کاهش تعداد سلول‌ها، کاهش تولید و تخریب ماتریکس خارج سلولی بافت دیسک بین مهره‌ای به خصوص در ناحیه‌ی نکلئوس پالپوزوس (NP) ایجاد می‌شود. در مهندسی بافت از داربست‌های طبیعی و غیر طبیعی مختلف برای ترمیم و رژنره شدن دیسک بین مهره‌ای استفاده می‌گردد. داربست‌های مورد استفاده باید تخریب پذیر و زیست سازگار باشند و محیط مناسبی برای تکثیر و مهاجرت سلول‌ها فراهم کنند. کیتوسان-ژلاتین و آلژینات از داربست‌های طبیعی خوبی هستند که برای این منظور مناسب هستند. برای شناسایی سلول‌های NP مارکر و روش خاصی وجود ندارد ولی بعضی مطالعات گزارش‌هایی از بیان بالای مارکرهای سیتوکراتین 19، 18 و 8 توسط تکنیک‌های Real time و ایمنوسیتوشیمی در سلول‌های NP منتشر کرده‌اند. هدف از این مطالعه شناسایی سلول‌های NP دیسک بین مهره‌ای انسانی توسط فلوسایتومتری مارکر سیتوکراتین 18، مقایسه‌ی میزان بقا، تکثیر و مورفولوژی سلول‌های NP در دو داربست آلژینات و کیتوسان-ژلاتین بود.

روش‌ها: سلول‌های NP با تجزیه‌ی آنزیمی کلاژناز از بافت NP بیماران مبتلا به فتق دیسک بین مهره‌ای در بیمارستان الزهرای (س) اصفهان تهیه شد. محلول کیتوسان با محلول ژلاتین مخلوط شد. پس از ایجاد ارتباط بین این دو محلول توسط گلوتارآلدیید، مخلوط حاصل پس از فریز کردن و Freeze-drying به عنوان داربست مورد استفاده قرار گرفت. داربست آلژینات نیز تهیه گردید. پس از تأیید NP بودن سلول‌های جدا شده توسط فلوسایتومتری کردن مارکر درون سلولی سیتوکراتین-18، سوسپانسیون سلولی حاوی سلول‌های NP جدا شده به دو داربست منتقل گردید و تا 21 روز کشت داده شدند. برای بررسی درصد سلول‌های زنده و میزان تکثیر از تکنیک‌های تریپان بلو و MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2,5-Diphenyltetrazolium bromide] استفاده گردید. برای اثبات وجود منافذ و بررسی ساختار داربست و مورفولوژی سلول‌ها نیز از میکروسکوپ SEM (Scaning electron microscop) استفاده شد.

یافته‌ها: نتایج فلوسایتومتری نشان داد که 60 سلول‌ زنده‌ مارکر سیتوکراتین 18 را بیان می‌کنند. نتایج MTT نیز نشان داد که درصد سلول‌های زنده در روز سوم نسبت به روز اول در هر دو داربست آلژینات و کیتوسان-ژلاتین اختلاف معنی‌داری داشت. همچنین درصد سلول‌های زنده از روز 3 تا 21 به صورت معنی‌داری کاهش یافت. نتایج شمارش سلول‌ها نشان داد که اختلاف میانگین تعداد سلول‌ها در داربست آلژینات به صورت معنی‌داری بیشتر از داربست کیتوسان-ژلاتین بود (001/0 > P).

نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که می‌توان از مارکر سیتوکراتین 18 توسط فلوسایتومتری برای شناسایی سلول‌های NP استفاده نمود. همچنین داربست آلژینات نسبت به داربست کیتوسان-ژلاتین محیط مناسب‌تری برای رشد و تکثیر سلول‌های NP انسانی در in vitro فراهم می‌کند. پیشنهاد می‌شود از این داربست برای کشت سلول‌های NP در in vivo استفاده گردد.

واژگان کلیدی: دیسک بین مهره‌ای، مهندسی بافت، کیتوسان، ژلاتین، آلژینات، سیتوکراتین 18


تمام متن:

PDF


Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.