دوره 30، شماره 193: هفته سوم مرداد ماه 1391

بهینه‌سازی تولید و خالص‌سازی آنزیم Taqپلیمراز موتاسیون یافته در ناحیه‌ی N666E

حمید میرمحمدصادقی, محمد ربانی, سمانه عصارزاده, فاطمه مؤذن

چکیده


مقدمه: آنزیم Taq پلیمراز به صورت گسترده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction یا PCR) کاربرد دارد. یکی از قسمت‌های مهم دخیل در فعالیت این آنزیم، منطقه‌ی O-helix آنزیم می‌باشد. طی تحقیقات قبلی یک وکتور بیانی شامل موتاسیون Asn-666-Glu بر روی ژن آنزیم طراحی شده است. به منظور بررسی تأثیر این موتاسیون بر روی فعالیت آنزیم در ابتدا باید به خالص‌سازی آنزیم Taq پلیمراز پرداخت. هدف از این پروژه، جداسازی و خالص‌سازی آنزیم Taq پلیمراز نوترکیب از گونه‌ی باکتری اشرشیاکلی Bl21 بود.

روش‌ها: در این مطالعه پس از ترانسفورم کردن سلول‌های پذیرا با پلاسمید حاوی ژن Taq پلیمراز موتانت شده در ناحیه‌ی N666E و القای بیان آنزیم با ایزوپروپیل بتا تیوگالاکتوزید (Isopropyl β-D thiogalactopyranoside یا IPTG) از روش‌های خالص‌سازی Desai، پروتکل Desai بهینه‌سازی شده، رزین- نیکل (Ni-NTA His.Bind Resins)، تری کلرو استیک اسید (Trichloroacetic acid  یا TCA) و رفولدینگ (Refolding) به منظور تخلیص آنزیم Taq پلیمراز استفاده گردید و در نهایت به مقایسه‌ی این روش‌ها با یکدیگر پرداخته شد.

یافته‌ها: در مقایسه‌ی نتایج با یکدیگر، استفاده از پروتکل Desai علاوه بر این که باندی شارپ در ناحیه‌ی مورد انتظار (94 کیلودالتون) ایجاد نمود، در سایر نواحی نیز باندهایی دیده شد؛ اما پس از بهینه‌سازی پروتکل Desai تنها باند مورد نظر قابل مشاهده بود. با استفاده از تری کلرو استیک اسید و رزین- نیکل باندهای دیده شده در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون ضعیف بود و گاهی باندهای دیگری در سایر نواحی دیده شد. با رفولدینگ آنزیم، باند ایجاد شده در ناحیه‌ی 66 کیلودالتون مشاهده شد.

نتیجه‌گیری: روش خالص‌سازی Desai که با استفاده از RNase و DNase بهینه‌سازی شده انجام شد، باعث ایجاد باندی واضح و مناسب در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون گردید. استفاده از تری کلرو استیک اسید به منظور رسوب پروتئین‌هایی که با حرارت از بین نرفته‌اند و استفاده از رزین- نیکل باعث حذف تقریبی باندهای ناخواسته شد، هر چند مقدار آنزیم مورد نظر را نیز در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون کاهش داد. در مورد باند 66 کیلودالتون ایجاد شده در فرایند رفولدینگ آنزیم، این احتمال وجود دارد که در حین جداسازی اینکلوژن بادی‌ها از سلول، باقی ماندن آنزیم پروتئاز باعث شکست آنزیم در این ناحیه شده باشد.

واژگان کلیدی: آنزیم Taq پلیمراز نوترکیب، خالص‌سازی Desai، O-helix mutation

تمام متن:

PDF


Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.