دوره 31، شماره 267: هفته اول اسفند ماه 1392:2162-2170

همسانه‌سازی و بیان آنزیم لیپواکسیژناز پوستی Ambystoma mexicanum (LOXe) در باکتری Escherichia Coli

مریم طحان, احمد موحدیان عطار, مهدی عباسیان, محمدرضا مفید

چکیده


مقدمه: آنزیم‌های لیپواکسیژناز نقش مهمی در انواع مکانیسم‌های موجودات زنده ایفا می‌کنند. تا کنون مطالعات زیادی بر روی عملکرد لیپواکسیژناز در انسان و سایر موجودات انجام گرفته است. فعال شدن این آنزیم در یوکاریوت‌ها و اثرگذاری روی سوبسترای خود (اسید آراشیدونیک) باعث تولید واسطه‌های گوناگونی می‌شود. یکی از محصولات واکنش این آنزیم لکوترین است. این واسطه‌ی التهابی نقش مهمی در فرایند ترمیم زخم ایفا می‌کند. مطالعات اخیر نشان داده ‌است که آنزیم لیپواکسیژناز LOXe استخراج شده از یک دوزیست (Ambystoma mexicanum) در مقایسه با لیپواکسیژناز انسانی تأثیری به مراتب بیشتر در فرایند بهبود زخم از خود نشان می‌دهد. تا به حال، همسانه‌سازی و بیان این ژن در باکتری انجام نشده است و از آن جا که اولین قدم برای شناسایی و تعیین ویژگی‌های هر پروتئین، در دست داشتن مقادیر زیادی از آن است، در تحقیق حاضر، همسانه‌سازی و بیان لیپواکسیژناز اکسولوتل (LOXe) مورد توجه قرار گرفت.

روش‌ها: ابتدا توالی کد کننده‌ی لیپواکسیژناز اکسولوتل بر اساس توالی آمینو اسیدی پروتئین مورد نظر، طراحی و پس از بهینه‌سازی کدون‌ها برای بیان حداکثری در باکتری E. coli (Escherichia coli)، در ناقل pUC57 قرار گرفت. قطعه‌ی کد کننده‌ی سنتز شده پس از هضم با آنزیم‌های برشی مورد نظر، در چهارچوب خواندن ناقل بیانی pET21-a قرار داده شد و در میزبان بیانی BL21-E. coli برای بیان پروتئین 71 کیلو دالتونی LOXe (623 اسید آمینه) در حضور IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) القا گردید.

یافته‌ها: کلونینگ LOXe با صحت انجام گرفت و بیان این آنزیم در باکتری E. coli امکان پذیر است.

نتیجه‌گیری: آنالیز SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) نشان دهنده‌ی بیان فراوان پروتئین مورد نظر در مقایسه با نمونه‌ی شاهد بود.

 


واژگان کلیدی


لیپواکسیژناز؛ Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis؛ pET21-a

تمام متن:

PDF

مراجع


Furstenberger G, Epp N, Eckl KM, Hennies HC, Jorgensen C, Hallenborg P, et al. Role of epidermis-type lipoxygenases for skin barrier function and adipocyte differentiation. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2007; 82(1-4): 128-34.

Schneider C, Pratt DA, Porter NA, Brash AR. Control of oxygenation in lipoxygenase and cyclooxygenase catalysis. Chem Biol 2007; 14(5): 473-88.

Yu Z. Discovery of a novel lipoxygenase pathway in skin [PhD Thesis]. Nashville, TN: Vanderbilt University; 2005.

Krieg P, Marks F, Furstenberger G. A gene cluster encoding human epidermis-type lipoxygenases at chromosome 17p13.1: cloning, physical mapping, and expression. Genomics 2001; 73(3): 323-30.

Green JA, Stockton RA, Johnson C, Jacobson BS. 5-lipoxygenase and cyclooxygenase regulate wound closure in NIH/3T3 fibroblast monolayers. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 287(2): C373-C383.

Yu Z, Schneider C, Boeglin WE, Brash AR. Mutations associated with a congenital form of ichthyosis (NCIE) inactivate the epidermal lipoxygenases 12R-LOX and eLOX3. Biochim Biophys Acta 2005; 1686(3): 238-47.

Menger B, Vogt PM, Allmeling C, Radtke C, Kuhbier JW, Reimers K. AmbLOXe--an epidermal lipoxygenase of the Mexican axolotl in the context of amphibian regeneration and its impact on human wound closure in vitro. Ann Surg 2011; 253(2): 410-8.

Satoh A, Bryant SV, Gardiner DM. Regulation of dermal fibroblast dedifferentiation and redifferentiation during wound healing and limb regeneration in the Axolotl. Dev Growth Differ 2008; 50(9): 743-54.

Zareie R, Abbasian M. Method to produce recombinant MBP8298 and other polypeptides by nucleotide structure optimization, 2011. [Patent NO.: 20110008827].

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

Brash AR. Lipoxygenases: occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate. J Biol Chem 1999; 274(34): 23679-82.

Baysal T, Demirdoven Ah. Lipoxygenase in fruits and vegetables: A review. Enzyme and Microbial Technology 2007; 40(4): 491-6.

Pidgeon GP, Lysaght J, Krishnamoorthy S, Reynolds JV, O'Byrne K, Nie D, et al. Lipoxygenase metabolism: roles in tumor progression and survival. Cancer Metastasis Rev 2007; 26(3-4): 503-24.

Yoshimura R, Matsuyama M, Tsuchida K, Kawahito Y, Sano H, Nakatani T. Expression of lipoxygenase in human bladder carcinoma and growth inhibition by its inhibitors. J Urol 2003; 170(5): 1994-9.

Maden M, Goodwin BC. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. J Embryol Exp Morphol 1980; 57: 177-87.

Seifert AW, Monaghan JR, Voss SR, Maden M. Skin regeneration in adult axolotls: a blueprint for scar-free healing in vertebrates. PLoS One 2012; 7(4): e32875.

Matsumoto T, Funk CD, Radmark O, Hoog JO, Jornvall H, Samuelsson B. Molecular cloning and amino acid sequence of human 5-lipoxygenase. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85(1): 26-30.

Sigal E, Craik CS, Highland E, Grunberger D, Costello LL, Dixon RA, et al. Molecular cloning and primary structure of human 15-lipoxygenase. Biochem Biophys Res Commun 1988; 157(2): 457-64.

Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 1999; 10(5): 411-21.




Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.