دوره 32، شماره 275: هفته چهارم فروردین ماه 1393:170-181

مقایسه‌ی تعداد نسخه‌های درج شده‌ی ژن 10-IP با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی بر اساس سیستم ترانسپوزونی PiggyBac در ژنوم سلول‌های Human embryonic kidney

هادی میرزاپور, آرزو کرم‌زاده, حسین خان احمد, رسول صالحی, مجید خیرالهی

چکیده


مقدمه: یکی از چالش‌های پیش رو در روش‌های مرسوم تولید پروتئین نوترکیب که ترانسژن به صورت خطی به سلول میزبان وارد می‌شود، هتروژنی در تعداد نسخه‌‌های ترانسژن در کلون‌های مختلف به دست آمده است که منجر به بیان ژن در سطوح مختلف می‌شود. گذشته از کارایی پایین درج خطی در ژنوم میزبان، پدیده‌ای دیگر به نام Position effect باعث کمتر شدن کارایی بیان ژن می‌گردد. PiggyBac کلاسی از DNA ترانسپوزونی است که می‌تواند به صورت مکانیزم Cut and paste در ژنوم سلول میزبان جابه‌جا شود. برخی خصوصیات منحصر به فرد این ترانسپوزون، آن را به یکی از وکتور‌های مناسب در مطالعات انتقال ژن تبدیل کرده است. انتقال ترانسژن با حجم بالا و درج در نواحی فعال از نظر رونویسی، از جمله خصوصیات مهم این ترانسپوزون است که می‌توان از آن در تولید پروتئین نوترکیب با کارایی بالا بهره برد. در این تحقیق، تعداد نسخه‌‌های درجی در کلون‌های به دست آمده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی این سیستم در رده‌ی سلولی HEK (Human embryonic kidney) مقایسه شده است.

روش‌ها: تولید سازه‌‌های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی سیستم ترانسپوزاز حاوی ژن 10-IP و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین با استفاده از روش‌های کلونینگ مولکولی به انجام رسید. رده‌ی سلولی HEK پس از تکثیر در پلیت‌های سلولی جهت انجام ترانسفکشن Seed شدند. سازه‌‌ها با استفاده از کیت لیپوفکتامین 2000 ترانسفکت شدند و پس از 48 ساعت مورد تیمار با آنتی بیوتیک هیگرومایسین به مدت دو هفته قرار گرفتند. کلون‌های به دست آمده پس از استخراج DNA ژنومی با تکنیک Absolute real-time PCR (Absolute real-time polymerase chain reaction) از نظر تعداد نسخه‌‌های ژنی درج شده مورد بررسی قرار گرفتند.

یافته‌ها: تعداد نسخه‌‌های ژنی به دست آمده با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی در هر سلول، برابر با 5 نسخه بود؛ در حالی که این عدد در سیستم دو پلاسمیدی برابر با دو نسخه بود.

نتیجه‌گیری: بررسی نتایج حاصل از تعداد نسخه‌‌های درجی در سیتم‌‌های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی نشان داد که سیستم تک پلاسمیدی کارایی بالاتری از لحاظ تعداد نسخه‌‌های درجی دارد و می‌توان با کلون کردن ژن مورد نظر و کاست بیان کننده‌ی آنزیم ترانسپوزاز در یک پلاسمید واحد، تعداد نسخ بیشتری جهت بیان بیشتر پروتئین نوترکیب به دست آورد.


واژگان کلیدی


PiggyBac ترانسپوزون؛ ژن درمانی؛ پروتئین نوترکیب؛ تعداد نسخه‌‌های ترانسژن

تمام متن:

PDF

مراجع


Gorman C, Bullock C. Site-specific gene targeting for gene expression in eukaryotes. Curr Opin Biotechnol 2000; 11(5): 455-60.

Matasci M, Baldi L, Hacker DL, Wurm FM. The PiggyBac transposon enhances the frequency of CHO stable cell line generation and yields recombinant lines with superior productivity and stability. Biotechnol Bioeng 2011; 108(9): 2141-50.

Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol 2007; 25(9): 425-32.

Kwaks TH, Otte AP. Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends Biotechnol 2006; 24(3): 137-42.

Weiler KS, Wakimoto BT. Heterochromatin and gene expression in Drosophila. Annu Rev Genet 1995; 29: 577-605.

Fraser MJ, Ciszczon T, Elick T, Bauser C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol 1996; 5(2): 141-51.

Ding S, Wu X, Li G, Han M, Zhuang Y, Xu T. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell 2005; 122(3): 473-83.

Bauser CA, Elick TA, Fraser MJ. Proteins from nuclear extracts of two lepidopteran cell lines recognize the ends of TTAA-specific transposons piggyBac and tagalong. Insect Mol Biol 1999; 8(2): 223-30.

Galvan DL, Nakazawa Y, Kaja A, Kettlun C, Cooper LJ, Rooney CM, et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother 2009; 32(8): 837-44.

Fraser MJ, Cary L, Boonvisudhi K, Wang HG. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology 1995; 211(2): 397-407.

Matasci M, Bachmann V, Baldi L, Hacker DL, De JM, Wurm FM. CHO cell lines generated by PiggyBac transposition. BMC Proc 2011; 5(Suppl 8): 31.

Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108(4): 1531-6.

Vink CA, Gaspar HB, Gabriel R, Schmidt M, McIvor RS, Thrasher AJ, et al. Sleeping beauty transposition from nonintegrating lentivirus. Mol Ther 2009; 17(7): 1197-204.




Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.