دوره 33، شماره 354: هفته دوم آذر ماه 1394:1691-1700

ساخت سازه‌ی ژنی pBud.CE4.1 IFNβ Wild Type و بررسی سطح بیان ژن اینترفرون بتای انسانی در رده‌ی سلولی HEK293 ترانسفکت شده با این سازه

راحله نوروزی, زهره حجتی

چکیده


مقدمه: اینترفرون بتا، از جمله سایتوکاین‌های مهمی است که در پاسخ به عوامل محرک و آنتی‌ژن‌ها بیان می‌شود و در فرایندهای ایمنی و التهاب نقش دارد. در این پژوهش، ضمن کلون نمودن ژن اینترفرون بتا در وکتور pBud.CE4.1، سطح بیان این ژن در مقایسه با حالت بیان پایه در رده‌ی سلولی انسانی HEK293 با استفاده از روش Real-time PCR (Real-time polymerase chain reaction) بررسی گردید.

روش‌ها: توالی ژن اینترفرون بتا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی حاوی جایگاه برش آنزیمی KpnI و BglII از روی وکتور pSVMdhfr حاوی این ژن تکثیر شد و سپس، در وکتور pBud.CE4.1 خطی شده با آنزیم‌های پیش‌گفته، کلون گردید. ساختار وکتور نوترکیب، با استفاده از روش هضم آنزیمی، Colony PCR و تعیین توالی، بررسی و در نهایت، به درون باکتری مستعد Escherichia coli TOP10 ترانسفورم شد. پس از تکثیر، پلاسمید نوترکیب استخراج و به رده‌ی سلولی HEK293 ترانسفکت گردید. استخراج RNA، سنتز cDNA (Complementary DNA) و بررسی سطح بیان با استفاده از روش Real-time PCR صورت گرفت.

یافته‌ها: ژن اینترفرون بتا، تحت پروموتر eEf1a وکتور با موفقیت در رده‌ی سلولی HEK293 بیان شد. سطح بیان این ژن در اثر ترانسفکشن، 9/79 برابر افزایش نسبت به شاهد را نشان داد. ترانسفکت وکتور فاقد ژن، افزایش بیان 87/2 برابری را نشان داد که احتمال می‌رود، به علت ورود یک ژنوم بیگانه باشد.

نتیجه‌گیری: پروتئین‌های تولید شده در سیستم‌های پروکاریوتی، فاقد گلیکوزیلاسیون می‌باشند و در نتیجه، خواص فیزیکوشیمیایی متفاوتی نسبت به حالت طبیعی دارند. بنا بر این، بیان ژن هدف در سلول انسانی تحت پروموتر قوی وکتور انتخابی، از مزایای پژوهش حاضر است. انجام مطالعات پروتئینی در این زمینه، می‌تواند هدف مطالعات آتی باشد.


واژگان کلیدی


اینترفرون بتا؛ رده‌ی سلولی HEK293؛ وکتور pBudCE4.1؛ Real-time polymerase chain reaction

تمام متن:

PDF

مراجع


Chelbi-Alix MK, Wietzerbin J. Interferon, a growing cytokine family: 50 years of interferon research. Biochimie 2007; 89(6-7): 713-8.

Pestka S, Krause CD, Walter MR. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev 2004; 202: 8-32.

Pang KR, Wu JJ, Huang DB, Tyring SK, Baron S. Biological and clinical basis for molecular studies of interferons. Methods Mol Med 2005; 116: 1-23.

Zago P, Baralle M, Ayala YM, Skoko N, Zacchigna S, Buratti E, et al. Improving human interferon-beta production in mammalian cell lines by insertion of an intronic sequence within its naturally uninterrupted gene. Biotechnol Appl Biochem 2009; 52(Pt 3): 191-8.

Friedman RM. Clinical uses of interferons. Br J Clin Pharmacol 2008; 65(2): 158-62.

Mark DF, Lin LS, Lu SDY. Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins [Google Patent: US4588585A]. 1986.

Runkel L, Meier W, Pepinsky RB, Karpusas M, Whitty A, Kimball K, et al. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta). Pharm Res 1998; 15(4): 641-9.

Hossler P, Khattak SF, Li ZJ. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology 2009; 19(9): 936-49.

Morris A, Zvetkova I. Cytokine research: the interferon paradigm. J Clin Pathol 1997; 50(8): 635-9.

Pestka S, Baron S. Definition and classification of the interferons. Methods Enzymol 1981; 78(Pt A): 3-14.

Meyer O. Interferons and autoimmune disorders. Joint Bone Spine 2009; 76(5): 464-73.

Bertolotto A, Deisenhammer F, Gallo P, Solberg SP. Immunogenicity of interferon beta: differences among products. J Neurol 2004; 251(Suppl 2): II15-II24.

Giovannoni G, Munschauer FE, III, Deisenhammer F. Neutralising antibodies to interferon beta during the treatment of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002; 73(5): 465-9.

Skoko N, Argamante B, Grujicic NK, Tisminetzky SG, Glisin V, Ljubijankic G. Expression and characterization of human interferon-beta1 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 2003; 38(Pt 3): 257-65.

Smith GE, Summers MD, Fraser MJ. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol 1983; 3(12): 2156-65.

Squires CH. Human interferon beta-1b production in Pseudomonas fluorescens. BioProcess International 2010; 8(7): 132.

Amir-Kalvangh P, Ebtekar M, Azadmanesh K, Hartoonian C, Mahdavi M. Cloning of human Ifnλ-1 (IL-29) from monocyte derived dcs and its expression in Hek 293 T. J Arak Univ Med Sci 2011; 14(57): 69-78. [In Persian].

Thomas P, Smart TG. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods 2005; 51(3): 187-200.

Pfaffl MV. Quantification strategies in real-time PCR. In: Bustin SA, editor. A-Z of quantitative PCR. La Jolla CA: International University Line; 2004. p. 87-112.




Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.