دوره 34، شماره 375: هفته سوم اردیبهشت ماه 1395:238-244

اندازه‌گیری آنتی‌بادی تولید شده علیه کپسول پلی ساکاریدی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات استخراج شده از هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b سویه‌ی محلی Atf2 با روش Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

شفق خادمی , فرهاد اسماعیلی , مهدی امینیان

چکیده


مقدمه: هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b (HIb یا Haemophilus influenza b) یک ارگانیزم کپسول‌دار و عامل اصلی مننژیت در کودکان در جهان می‌باشد. آنتی‌ژن کپسول پلی‌ساکاریدی HIb یک پلیمر تکراری از ریبوزیل ریبیتول فسفات و مهم‌ترین عامل ویرولانس و مسبب عفونت‌های بسیار در کودکان زیر 5 سال به خصوص کودکان زیر 2 سال می‌باشد. کپسول پلی‌ساکاریدی کانژوگه با یک حامل پروتئینی، در جلوگیری از چنین عفونت‌هایی بسیار مؤثر است.

روش‌ها: در این مطالعه، HIb سویه‌ی Atf2 جدا شده از یک کودک مبتلا به مننژیت، در فرمانتور حاوی محیط اصلاح شده‌ی Giolitti-Cantoni broth (GC broth) کشت داده شد. کشت حاصل، بعد از غیر فعال شدن با استفاده از روش‌های مختلف تخلیص و آنتی‌ژن پلی‌ساکاریدی (PRP یا Polyribosylribitolphosphate) تهیه شده بعد از عبور از فیلتر 25/0 میکرومتری با توکسوئید کزاز (TT یا Tetanus toxoid) به عنوان حامل پروتئینی کونژوگه گردید. محصول کونژوگه، پس از عبور از ژل سفارز CL-4B جداسازی شد و به عنوان محصول کونژوگه PRP-TT مورد استفاده قرار گرفت.

یافته‌ها: مقدار PRP موجود در محصول کونژوگه 402 میکروگرم از 109 باکتری در هر میلی‌لیتر تخلیص شد. مقدار پروتئین و اسیدنوکلئیک موجود در PRP مطابق با مقدار توصیه شده توسط World Health Organization (WHO) زیر 1 درصد بود. بازیافت PRP موجود در محصول کونژوگه بعد از استفاده از Sodium deoxycholate (DOC)، 58 درصد بود که نشان دهنده‌ی مقدار بالای اتصال PRP و پروتئین اولیه بود. پاسخ آنتی‌بادی علیه محصول کونژوگه (PRP-TT) تهیه شده در نوزاد رت با نژاد ویستار با روش Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) غیر مستقیم اندازه‌گیری و بالاترین تیتر برای محصول کونژوگه نسبت به PRP استخراج شده در آزمایشگاه و PRP استاندارد خریداری شده از مؤسسه‌ی بین‌المللی استانداردهای بیولوژی در لندن (National Institute for Biological Standards And Control یا NIBSC) به دست آمد. در تیتر آنتی‌بادی به دست آمده برای PRP تخلیص شده و خریداری شده از NIBSC در غلظت برابر آنتی‌ژن و رقت 200/1 آنتی‌بادی شباهت زیادی دیده شد که این نشانگر خلوص PRP تهیه شده در آزمایشگاه می‌باشد.

نتیجه‌گیری: روش تخلیص PRP، کونژوگاسیون و ایمنی‌زایی محصول کونژوگه در مدل حیوانی نوزاد رت روشی مقرون به صرفه و عملی با خلوص بالا است که می‌توان از آن درتولید واکسن HIb با حجم بالا (Scale up) استفاده کرد.


واژگان کلیدی


هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b؛ پلی‌ریبوزیل ریبیتول فسفات؛ کونژوگاسیون؛ Enzyme-linked immunosorbent assay

تمام متن:

PDF

مراجع


Brooks GF, Butel JS, Morse SA. Jawetz, Melnick and Adelberg's medical microbiology. 24th ed. New York, NY: McGraw-Hill Medical; 2007.

Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology. 6th ed. Philadelphia, PA: Saunders; 2005.

Hilleman MR, Tai JY, Tolman RL, Vella PP. Coupled H. influenzae type b vaccine [US Patent 4,459,286]. 1984.

Marburg S, Kniskern PJ, Tolman RL. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with big eneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency. [US Patent: Registration No. 4 882 317]. 1989.

Davey PG, Cruikshank JK, McManus IC, Mahood B, Snow MH, Geddes AM. Bacterial meningitis--ten years experience. J Hyg (Lond ) 1982; 88(3): 383-401.

Barbour ML, Mayon-White RT, Coles C, Crook DW, Moxon ER. The impact of conjugate vaccine on carriage of Haemophilus influenzae type b. J Infect Dis 1995; 171(1): 93-8.

Kelly DF, Moxon ER, Pollard AJ. Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines. Immunology 2004; 113(2): 163-74.

Granoff DM, Cates KL. Haemophilus influenzae type b polysaccharide vaccines. J Pediatr 1985; 107(3): 330-6.

Eskola J, Ward J, Dagan R, Goldblatt D, Zepp F, Siegrist CA. Combined vaccination of Haemophilus influenzae type b conjugate and diphtheria-tetanus-pertussis containing acellular pertussis. Lancet 1999; 354(9195): 2063-8.

Mawas F, Bolgiano B, Rigsby P, Crane D, Belgrave D, Corbel MJ. Evaluation of the saccharide content and stability of the first WHO International Standard for Haemophilus influenzae b capsular polysaccharide. Biologicals 2007; 35(4): 235-45.

Afshar M, Esmaily F, Aminian M, Asli E, Haadi E, Torabi M, et al. A study on Haemophilus influenzae type b growth rate and capsule production in different media. Archves of Razi Institute 2012; 67(1): 7-12.

Esmaily F, Aminian M, Tavangar AR, Hadi A. Comparison of bacterial biomass and PRP production between different isolates of Haemophilus influenza type b (Hib) under different culture conditions. Archives of Razi Institute 2011; 66(1): 43-9.

Takagi M, Lima RB, Albani SM, Zangirolami TC, Tanizaki MM, Cabrera-Crespo J. Purification of capsular polysaccharide produced by Haemophilus influenzae type b through a simple, efficient and suitable method for scale-up. J Ind Microbiol Biotechnol 2008; 35(11): 1217-22.

Peltola H. Worldwide Haemophilus influenzae type b disease at the beginning of the 21st century: Global analysis of the disease burden 25 years after the use of the polysaccharide vaccine and a decade after the advent of conjugates. Clin Microbiol Rev 2000; 13(2): 302-17.

Chu C, Schneerson R, Robbins JB, Rastogi SC. Further studies on the immunogenicity of Haemophilus influenzae type b and pneumococcal type 6A polysaccharide-protein conjugates. Infect Immun 1983; 40(1): 245-56.

Madore DV, Anderson P, Baxter BD, Carlone GM, Edwards KM, Hamilton RG, et al. Interlaboratory study evaluating quantitation of antibodies to Haemophilus influenzae type b polysaccharide by enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol 1996; 3(1): 84-8.




Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License which allows users to read, copy, distribute and make derivative works for non-commercial purposes from the material, as long as the author of the original work is cited properly.