دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی-درمانی استان اصفهان مجله دانشکده پزشکی اصفهان 1027-7595 27 102 2010 01 21 Access to a Three Dimentional Osteoblasts Culture Originating Human carvaria in Iran دستیابی به کشت سه بعدی سلول‌های استئوبلاست مشتق از کالواریای انسانی در ایران 777 787 13094 FA عباسعلی ربیعی استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان ابراهیم اسفندیاری استاد، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان مهرآفرین فشارکی مربی، گروه فیزیولوژی، دانشکده‌ی ‌پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان معصومه سنایی مربی گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جهرم، جهرم بهرام امین منصور استادیار، جراح مغز و اعصاب، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان بتول هاشمی بنی استاد، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان Journal Article 2010 11 07 Background: The problem of bone defects during treatments of bone lesions, especially cranial trauma, and also during craniotomy operations indicates isolation of osteoblasts and culturing them for filling these bone effects. Methods: Bone tissue specimens were obtained from 6 patients’ carvaria undergoing craniotomy surgery operations in Al-zahra teaching hospital and transferred to lab. These specimens were cut into small pieces measuring 1 × 1 mm and put in Petri dishes having culture medium and then transferred to the incubator. The mean interval of observed cellular outgrowth was 9-10 days. After 2 weeks, the cells in cultures reached confluencey. First passage cells were detached from Petri dishes, using Trypsin EDTA, and were divided in two portions. One portion was used for monolayer osteoblast culture, and the other, was added to alginate gel. The activity of these cells was tested by Alkalin phosphatase, Von kossa and Azan staining. Cell viability was also tested by Trypan blue staining. Findings: The morphology of osteoblasts in monolayer cultures appeared fusiform and fibroblastic, while in the alginate beads, cells appearance was round. Alkaline phosphatase staining method confirmed the presence of osteoblasts. Von kossa and Azan staining demonstrated, mineralized and organised matrix in both groups. The number of harvested cells in day 1 and day 21 were significantly different in each group (P < 0.001). In addition, there was significant difference in the mean of cells number and viability between monolayer cultures and alginate beads in day 21 (P < 0.001). Conclusion: This study showed that osteoblasts can come out from bones in dish culture without using any enzyme; and sodium Alginate gel supports cell viability and proliferation of osteoblasts cells significantly in comparison with the monolayer culture. Key words: Osteoblast, Monolayer culture, Alginate, Alkaline phosphatase. مقدمه: شیوع بالای نقایص استخوانی در بیماران دچار ضربه در تصادفات و بروز کمبود بافت استخوانی در اعمال جراحی کرانیوتومی، ضرورت تام و تمام در تحقیق حاضر سلول‌های استئوبلاست به دست آمده از استخوان کالواریا در محیط سه بعدی آلژینات کشت داده شد و میزان تکثیر و زنده ماندن آن‌ها با سلول‌های حاصل از کشت تک لایه‌ای مقایسه گردید. روش ها: در جریان اعمال جراحی کرانیوتومی 6 نمونه‌ی استخوانی در اندازه‌های 1 × 1 سانتی‌متر از استخوان کالواریا تحت شرایط استریل بر داشته و پس از جداسازی بافت‌های همبند و شستشوی مکرر با سرم فیزیولوژی، قطعات استخوانی به ابعاد کوچک در حدود 1 × 1 میلی‌متر خرد شد و در دیش‌های محتوی محیط کشت قرار داده شد و به انکوباتور محتوی 5 درصد دی اکسید کربن با رطوبت نسبی و دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد منتقل گردید. پس از گذشت 9 تا 10 روز، سلول‌ها شروع به خروج از استخوان نمودند و 2 هفته پس از شروع کشت، سلول‌ها کف پلیت را به طور کامل پوشاندند. پس از تریپسینه کردن و شمارش، سلول‌ها به طور مساوی به دو بخش تقسیم گردید و کشت تک لایه‌ای و در محیط دارای ژل آلژینات انجام شد. جهت اثبات وجود سلول‌های استئوبلاست و فعالیت آن‌ها از رنگ‌آمیزی‌های Von kossa ,Alkaline phosphatase و Azan استفاده شد. برای بررسی درصد زنده ماندن سلول‌ها از رنگ‌آمیزی Trypan blue استفاده گردید. یافته ها: در کشت تک لایه‌ای، سلول‌ها با ظاهری شبه فیبروبلاستی و دوکی مشخص گردید در حالی که در کشت آلژینات، سلول‌ها نمای مدور داشت. در هر دو نوع کشت، تکثیر سلولی و فعالیت استخوان سازی وجود داشت. رنگ‌آمیزی Alkaline phosphatase در دو گروه وجود سلول‌های استئوبلاست را به اثبات رسانید و رنگ‌آمیزی‌های Von kossaو Azanوجود ماتریکس معدنی و آلی را در دو گروه تأیید کرد. با مقایسه تعداد سلول‌ها در روز 21 با تعداد سلول‌ها در روز 1 همان گروه، اختلاف معنی‌داری مشخص شد (001/0 > P). همچنین شمارش سلولی دو گروه در روز 21 نشان داد که میزان تکثیر در گروه آلژینات نسبت به گروه تک لایه‌ای بیشتر بوده، اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (001/0 > P) . نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که سلول‌های استئوبلاستی بدون استفاده از آنزیم در محیط کشت قادر به خروج از بافت استخوانی است و محیط سه بعدی ژل آلژینات سدیم در مقایسه با کشت تک لایه‌، قادر است تکثیر و بقای این سلول‌ها را به طور بارز افزایش دهد. استئوبلاست، کشت تک لایه، آلژینات، آلکالین فسفاتاز. https://jims.mui.ac.ir/article_13094_f96e42572185f05478d84f901007f164.pdf