کلون، بیان و تخلیص پروتئین ضد میکروبی LL-37 و بررسی اثر آن بر Acinetobacter baumannii مقاوم به دارو

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، اراک، ایران

2 دانشیار، مرکز تحقیقات پزشکی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، اراک، ایران

3 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده‌ی کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: مقاومت به آنتی‌بیوتیک، یک معضل جهانی است. یکی از راه‌های مقابله با این معضل، تولید داروهای جایگزین می‌باشد. در همین راستا، امروزه تحقیقات گسترده‌ای پیرامون پپتیدهای ضد میکروبی علیه عوامل بیماری‌زا در حال انجام است. یکی از این پپتیدها، LL-37 می‌باشد که از نظر بار کاتیونیک و دارای فعالیت ضد باکتریایی، ضد ویروسی و ضد سرطان می‌باشد. از این رو، هدف از انجام مطالعه‌ی حاضر، بررسی فعالیت ضد میکروبی پپتید LL-37 بر روی Acinetobacter baumannii مقاوم به دارو بود.روش‌ها: ابتدا، ژن LL-37 به وکتور pET-32a متصل گردید. سپس، DNA نوترکیب ایجاد شده، جهت تولید پروتئین به درون باکتری میزبان ترانسفورم شد. پس از تولید و تخلیص پروتئین نوترکیب، جهت فعال شدن پروتئین، دیالیز در بافر Phosphate buffered saline (PBS) انجام شد. سپس، کارایی پپتید LL-37 بر روی باکتری Acinetobacter baumannii مقاوم به دارو با استفاده از روش‌های رایج آزمایشگاهی مانند Minimum inhibitory concentration (MIC)، مورد ارزیابی قرار گرفت.یافته‌ها: میزان MIC برای پروتئین LL-37 بر روی باکتری Acinetobacter baumannii ATCC 19606، 5/1 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. همچنین، یافته‌های حاصل از آزمایش سنجش اکتیویته‌ی پروتئین، حاکی از آن بود که پروتئین نوترکیب تولید شده، می‌تواند منجر به مهار رشد و از بین رفتن باکتری گردد.نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج این مطالعه، پروتئین LL-37 در مقایسه با سایر پپتیدها و داروها در دیگر مطالعات، از کارایی بالاتری برخوردار می‌باشد؛ به طوری که در غلظت‌های خیلی پایین، باعث نابودی باکتری می‌گردد که نویدبخش آینده‌ای روشن برای درمان عفونت‌های ناشی از Acinetobacter baumannii مقاوم به دارو است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning, Expression, and Purification of Antimicrobial Peptide LL-37 and Assessment of its Antimicrobial Effectiveness on Multiple-Drug-Resistant Acinetobacter Baumannii

نویسندگان [English]

  • Ehsan Zarei-Mehrvarz 1
  • Ehsanollah Ghaznavi-Rad 2
  • Shohreh Fahimi-Rad 3
  • Hamid Abtahi 2
1 MSc Student, Department of Medical Biotechnology, School of Medicine, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran
2 Associate Professor, Molecular and Medicine Research Center, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran
3 Department of Agricultural Biotechnology, School of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
چکیده [English]

Background: Now a day, antibiotic resistance is a global problem. A way to solve this problem is production of alternative drugs. In this regard, today so many researches on antimicrobial peptides against pathogens are being done. LL-37 peptide is one of these peptides that is cationic and has antibacterial, antiviral, and anticancer activity. This project aimed to study the antimicrobial effectiveness of peptide LL-37 on multiple-drug-resistant (MDR) Acinetobacter baumannii.Methods: First, the LL-37 gene was linked to the pET-32a vector; then, recombinant DNA was transformed into the host bacteria and inducted to produce proteins. After the production and purification of recombinant proteins, to activate the protein, dialysis was performed in phosphate buffered saline (PBS). Then, the efficiency of peptide LL-37 on multiple-drug-resistant Acinetobacter baumannii was tested using common laboratory tests such as minimum inhibitory concentration (MIC).Findings: The minimum inhibitory concentration of LL-37 on Acinetobacter baumannii ATCC19606 was 1.5 µg/ml. In addition, the activity test showed that the recombinant proteins could inhibit the growth and decay the bacteria.Conclusion: The results of this study show that LL-37 protein, in comparison to other peptides and drugs in other studies, is more efficient and in low concentration can cause destruction of bacteria. This can herald a bright future for the treatment of infections caused by multiple-drug-resistant Acinetobacter baumannii.

کلیدواژه‌ها [English]

  • LL-37 antibacterial peptide
  • Antimicrobial drug resistance
  • Acinetobacter baumannii

مراجع

  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Antibiotic resistance threats in the United States. Atlanta, GA: CDC; 2013.
  2. Zeth K. Structure and mechanism of human antimicrobial peptide dermcidin and its antimicrobial potential. In: Mendez-Vilas A, editor. Microbial pathogens and strategies for combating them: Science, technology and education. Badajoz, Spain: Formatex Research Center; 2013. p. 1333-42.
  3. Rivera G, Bulnes J, Castillo C, Ajenjo MC, Garcia P, Labarca J. Extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated in a university hospital: Role of inter-hospital transmission. J Infect Dev Ctries 2016; 10(1): 96-9.
  4. Spence RP, Towner KJ, Henwood CJ, James D, Woodford N, Livermore DM. Population structure and antibiotic resistance of Acinetobacter DNA group 2 and 13TU isolates from hospitals in the UK. J Med Microbiol 2002; 51(12): 1107-12.
  5. Penchovsky R, Traykovska M. Designing drugs that overcome antibacterial resistance: where do we stand and what should we do? Expert Opin Drug Discov 2015; 10(6): 631-50.
  6. Nguyen LT, Haney EF, Vogel HJ. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. Trends Biotechnol 2011; 29(9): 464-72.
  7. Brogden KA. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 2005; 3(3): 238-50.
  8. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002; 415(6870): 389-95.
  9. Wang Z, Wang G. APD: The Antimicrobial Peptide Database. Nucleic Acids Res 2004; 32(Database issue): D590-D592.
  10. Wang G, Li X, Wang Z. APD2: the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design. Nucleic Acids Res 2009; 37(Database issue): D933-D937.
  11. Zanetti M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J Leukoc Biol 2004; 75(1): 39-48.
  12. Agerberth B, Charo J, Werr J, Olsson B, Idali F, Lindbom L, et al. The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and alpha-defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations. Blood 2000; 96(9): 3086-93.
  13. Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J, Bergman T, Olsson B, Salcedo R. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes. Eur J Biochem 1996; 238(2): 325-32.
  14. Oren Z, Lerman JC, Gudmundsson GH, Agerberth B, Shai Y. Structure and organization of the human antimicrobial peptide LL-37 in phospholipid membranes: relevance to the molecular basis for its non-cell-selective activity. Biochem J 1999; 341(Pt 3): 501-13.
  15. Wang G, Mishra B, Epand RF, Epand RM. High-quality 3D structures shine light on antibacterial, anti-biofilm and antiviral activities of human cathelicidin LL-37 and its fragments. Biochim Biophys Acta 2014; 1838(9): 2160-72.
  16. Mahmoudi S, Abtahi H, Bahador A, Mosayebi G, Salmanian AH, Teymuri M. Optimizing of Nutrients for High Level Expression of Recombinant Streptokinase Using pET32a Expression System. Maedica (Buchar) 2012; 7(3): 241-6.
  17. Farhangnia L, Ghaznavi-Rad E, Mollaee N, Abtahi H. Cloning, Expression, and Purification of Recombinant Lysostaphin From Staphylococcus simulans. Jundishapur J Microbiol 2014; 7(5): e10009.
  18. Krijgsveld J, Zaat SA, Meeldijk J, van Veelen PA, Fang G, Poolman B, et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J Biol Chem 2000; 275(27): 20374-81.
  19. Jorgensen JH, Crawford SA. Assessment of two commercial susceptibility test methods for determination of daptomycin MICs. J Clin Microbiol 2006; 44(6): 2126-9.
  20. Prakash V, Lewis JS, Jorgensen JH. Vancomycin MICs for methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates differ based upon the susceptibility test method used. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52(12): 4528.
  21. Koeth LM, DiFranco-Fisher JM, McCurdy S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J Vis Exp 2015; (103).
  22. Satishkumar R, Sankar S, Yurko Y, Lincourt A, Shipp J, Heniford BT, et al. Evaluation of the antimicrobial activity of lysostaphin-coated hernia repair meshes. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55(9): 4379-85.
  23. Farhang Nia L, Ghaznavi Rad E, Molaee N, Abtahi H. Cloning, expression and purification of recombinant prolysostaphin protein and evaluating its in vitro antistaphylococcal activity. Koomesh 2014; 15 (4): 441-8. [In Persian].
  24. Hajikhani B, Najar Peerayeh S, Soleimanjahi H, Hassan ZM. Cloning, expression, purification and antigenicity of recombinant UreB332-HpaA fusion protein from Helicobacter pylori. Modares J Med Sci Pathol 2017; 13(2): 1-10. [In Persian].
  25. Demain AL, Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv 2009; 27(3): 297-306.
  26. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 1999; 10(5): 411-21.
  27. Gordon YJ, Huang LC, Romanowski EG, Yates KA, Proske RJ, McDermott AM. Human cathelicidin (LL-37), a multifunctional peptide, is expressed by ocular surface epithelia and has potent antibacterial and antiviral activity. Curr Eye Res 2005; 30(5): 385-94.
  28. Moffatt JH, Harper M, Harrison P, Hale JD, Vinogradov E, Seemann T, et al. Colistin resistance in Acinetobacter baumannii is mediated by complete loss of lipopolysaccharide production. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54(12): 4971-7.
  29. Vila-Farres X, Garcia dlM, Lopez-Rojas R, Pachon J, Giralt E, Vila J. In vitro activity of several antimicrobial peptides against colistin-susceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii. Clin Microbiol Infect 2012; 18(4): 383-7.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 35، شماره 441 - شماره پیاپی 441
مهر و آبان 1396
صفحه 954-960

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 23 خرداد 1396
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار