شناسایی ایزوله‌های بالینی مایکوباکتریوم‌های غیر توبرکلوزیس شایع اصفهان با روش PCR-RFLP analysis ژن rpoB

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 استادیار، مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی و گرمسیری و گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

3 دانشیار، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 استادیار، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

5 پزشک عمومی، مرکز سل استان، معاونت درمان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: مطالعه جهت تشخیص جنس مایکوباکتریوم، معیاری را برای بررسی اپیدمیولوژی و پاتوژنز این گروه از باکتری‌ها در نواحی جغرافیایی مختلف فراهم می‌کند. با توجه به شیوع عفونت‌های ناشی از مایکوباکتریوم در ایران و همچنین همسایگی ایران با دو کشور افغانستان و پاکستان که در زمره‌ی 22 کشور High burden دنیا هستند، ضرورت توجه بیش از پیش به این بیماری و ارایه‌ی مولکولار اپیدمیولوژی بیماری‌های مایکوباکتریال روشن می‌گردد. PCR-RFLP analysis (PRA یا Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis) یک روش دقیق و ارزان می‌باشد که تشخیص گونه‌های‌ مایکوباکتریوم را فراهم می‌‌آورد. این مطالعه با هدف تعیین پروفایل قطعات محدود شونده با استفاده از روش پیش‌گفته برای مشخص نمودن تایپ‌های شایع مایکوباکتریوم‌های غیر توبرکلوزیس اصفهان انجام گردید.روش‌ها: 34 ایزوله‌ی بالینی پس ازگردآوری و کشت توسط روش فنوتیپی تشخیص داده شدند. یک قطعه‌ی bp 360 از ژن rpoB با روش PCR (Polymerase chain reaction) تکثیر گردید و سپس محصولات PCR تحت تأثیر دو آنزیم MspI (Moraxella sp.) و HaeIII (Haemophilus aegyptius bacteria) قرار گرفتند. قطعات حاصل از هضم توسط آنزیم با استفاده از ژل متافور آگارز 4 درصد الکتروفورز شدند و مورد آنالیز قرار گرفتند.یافته‌ها: در بین 34 گونه NTM (Nontuberculous mycobacteria) مورد بررسی تایپ I مایکوباکتریوم فورچئیتوم با فراوانی 35/82 درصد بیشترین نمونه‌ی جدا شده از مجموعه‌ی نمونه‌های بالینی این منطقه بود و پس از آن، مایکوباکتریوم کانزاسی تایپ I و مایکوباکتریوم گوردونه تایپ I هر دو با 88/5 درصد و مایکوباکتریوم گوردونه‌ی تایپ II و مایکوباکتریوم اینتراسلولار با 94/2 درصد جدا گردیدند.نتیجه‌گیری: روش PRA rpoB gene به کار گرفته شده جهت تشخیص گونه‌های مایکوباکتریوم، نتایج معتبری را با توجه به نتایج دیگر مطالعات، در این منطقه‌ی جغرافیایی ارایه نمود. الگوی PRA گونه‌های‌ مایکوباکتریوم‌ کانزاسی‌ ساب تایپ I (175/60/40/30 MspI:، 205/90 HeaIII:) و مایکوباکتریوم اویوم (105/80/40 MspI:، 270 HeaIII:) حاصل از این مطالعه با الگوی به دست آمده از بعضی مطالعات، یکسان بود؛ اما با پروفایل تعدادی دیگر همسان نبود. این روش، توانست 100 درصد ایزوله‌های مایکوباکتریوم غیر توبرکلوزیس را شناسایی کند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Identification of Non-Tuberculosis Mycobacteria Isolates by Polymerase Chain Reaction–Restriction Enzyme Analysis of 360-bp Fragment of rpoB Gene

نویسندگان [English]

  • Shima Hadifar 1
  • Sharareh Moghim 2
  • Hajieh Gasemian-Safaei 3
  • Hosein Fazeli 4
  • Fariba Farid 5
  • Mohsen Moghoofei 1
  • Mansour Sedighi 1
  • Bahram Nasr-Esfahani 3
1 MSc Student, Department of Microbiology, School of Medicine AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Assistant Professor, Nosocomial Infection Research Center AND Department of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Associate Professor, Department of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4 Assistant Professor, Infectious Diseases and Tropical Medicine Research Center AND Department of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
5 General Practitioner, Isfahan Provincial Tuberculosis Center, Deputy of Treatment, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Background: Diagnosis of mycobacterium genus provides a basis for investigating the epidemiology and pathogenesis of this group of bacteria. Regarding the prevalence of mycobacterial infection in Iran and because of the being neighborhood with countries among 22 high-burden countries, increasing attention to mycobacterial diseases and introducing molecular epidemiology of Mycobacteria seems to be necessary. Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Fragments (PCR-RFLP) is an inexpensive and accurate method providing diagnosis of mycobacterial species. The present study aimed to determine the common types of Mycobacteria in this geographical region by mentioned method.Methods: 34 clinical isolates were collected and cultured and identified by phenotypic methods. A 360-bp fragment of the rpoB gene was amplified by PCR and then, PCR products were digested by the two enzymes, MspI and HaeIII. Digested fragments were analyzed by using 4% metaphor agarose gel electrophoresis.Findings: Out of 34 species of nontuberculous mycobacteria (NTMs), M. fortuitum type I with the frequency of 82.35% was the most frequent type and M. gordonae type I and M. kansasii type I both with the frequency of 5.88% and M. gordonae type II and M. intracellular both with the frequency of 2.94% were the next.Conclusion: The PCR-RFLP analysis of rpoB gene used for identification of Mycobacteria provided valid results in this geographical area. In this study, M. kansasii type I (HeaIII: 90/205, MspI: 30/40/60/175) and M. avium (HeaIII: 270; MspI: 40/80/105) were identical to the patterns of some studies and different from others. This study demonstrated the high sensitivity (100%) of used PCR-RFLP analysis method for identification of Mycobacteria.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nontuberculous mycobacteria
  • rpoB gene
  • Identification

مراجع

  1. Konig B, Tammer I, Sollich V, Konig W. Intra- and interpatient variability of the hsp65 and 16S-23S intergenic gene region in Mycobacterium abscessus strains from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol 2005; 43(7): 3500-3.
  2. Lee AS, Jelfs P, Sintchenko V, Gilbert GL. Identification of non-tuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing. J Med Microbiol 2009; 58(Pt 7): 900-4.
  3. Ellis SM. The spectrum of tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infection. Eur Radiol 2004; 14(Suppl 3): E34-E42.
  4. Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA, Catanzaro A, Daley C, Gordin F, et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med 2007; 175(4): 367-416.
  5. Lee H, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ. Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene. J Clin Microbiol 2000; 38(8): 2966-71.
  6. Kazumi Y, Mitarai S. The evaluation of an identification algorithm for Mycobacterium species using the 16S rRNA coding gene and rpoB. International Journal of Mycobacteriology 2012; 1(1): 21-8.
  7. Nasr EB, Rezaei YH, Moghim S, Ghasemian SH, Zarkesh EH. Rapid and accurate identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous mycobacteria by multiplex real-time PCR targeting different housekeeping genes. Curr Microbiol 2012; 65(5): 493-9.
  8. Foxman B, Zhang L, Koopman JS, Manning SD, Marrs CF. Choosing an appropriate bacterial typing technique for epidemiologic studies. Epidemiol Perspect Innov 2005; 2: 10.
  9. Covert TC, Rodgers MR, Reyes AL, Stelma GN, Jr. Occurrence of nontuberculous mycobacteria in environmental samples. Appl Environ Microbiol 1999; 65(6): 2492-6.
  10. Varma-Basil M, Garima K, Pathak R, Dwivedi SK, Narang A, Bhatnagar A, et al. Development of a novel PCR restriction analysis of the hsp65 gene as a rapid method to screen for the Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria in high-burden countries. J Clin Microbiol 2013; 51(4): 1165-70.
  11. Adekambi T, Drancourt M, Raoult D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol 2009; 17(1): 37-45.
  12. Lee H, Bang HE, Bai GH, Cho SN. Novel polymorphic region of the rpoB gene containing Mycobacterium species-specific sequences and its use in identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 2003; 41(5): 2213-8.
  13. Neonakis IK, Gitti Z, Krambovitis E, Spandidos DA. Molecular diagnostic tools in mycobacteriology. J Microbiol Methods 2008; 75(1): 1-11.
  14. Butler WR, Guthertz LS. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species. Clin Microbiol Rev 2001; 14(4): 704-26, table.
  15. Tortoli E, Mariottini A, Mazzarelli G. Evaluation of INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2: improved reverse hybridization multiple DNA probe assay for mycobacterial identification. J Clin Microbiol 2003; 41(9): 4418-20.
  16. Cheunoy W, Prammananan T, Chaiprasert A, Foongladda S. Comparative evaluation of polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis: two amplified targets, hsp65 and rpoB, for identification of cultured mycobacteria. Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 51(3): 165-71.
  17. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33(9): 2233-9.
  18. Ong CS, Ngeow YF, Yap SF, Tay ST. Evaluation of PCR-RFLP analysis targeting hsp65 and rpoB genes for the typing of mycobacterial isolates in Malaysia. J Med Microbiol 2010; 59(Pt 11): 1311-6.
  19. Whang J, Lee BS, Choi GE, Cho SN, Kil PY, Collins MT, et al. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene for identification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and differentiation of Mycobacterium avium subspecies. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70(1): 65-71.
  20. Macheras E, Roux AL, Bastian S, Leao SC, Palaci M, Sivadon-Tardy V, et al. Multilocus sequence analysis and rpoB sequencing of Mycobacterium abscessus (sensu lato) strains. J Clin Microbiol 2011; 49(2): 491-9.
  21. Simmon KE, Low YY, Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr., Petti CA. Phylogenetic analysis of Mycobacterium aurum and Mycobacterium neoaurum with redescription of M. aurum culture collection strains. Int J Syst Evol Microbiol 2009; 59(Pt 6): 1371-5.
  22. Adekambi T, Colson P, Drancourt M. rpoB-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol 2003; 41(12): 5699-708.
  23. Kim BJ, Lee SH, Lyu MA, Kim SJ, Bai GH, Chae GT, et al. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J Clin Microbiol 1999; 37(6): 1714-20.
  24. Devulder G, Perouse de MM, Flandrois JP. A multigene approach to phylogenetic analysis using the genus Mycobacterium as a model. Int J Syst Evol Microbiol 2005; 55(Pt 1): 293-302.
  25. Adekambi T, Berger P, Raoult D, Drancourt M. rpoB gene sequence-based characterization of emerging non-tuberculous mycobacteria with descriptions of Mycobacterium bolletii sp. nov., Mycobacterium phocaicum sp. nov. and Mycobacterium aubagnense sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2006; 56(Pt 1): 133-43.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 31، شماره 266 - شماره پیاپی 266
بهمن و اسفند 1392
صفحه 2131-2138

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 13 آذر 1392
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار