بیان و تخلیص DNA پلیمراز Pfu متعلق به خانواده‌ی B

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی داروسازی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

3 کارشناس ارشد، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده‌ی کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان، اصفهان، ایران

4 استادیار، گروه بیوشیمی بالینی و مرکز تحقیقات بیوانفورماتیک، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: DNA پلیمرازها آنزیم‌هایی هستند که سنتز مولکول DNA را از دئوکسی ریبونوکئوتیدها بر عهده دارند. این آنزیم‌ها ابزارهای ضروری در زیست شناسی مولکولی به حساب می‌آیند. DNA پلیمراز Pfu از یک آرکئوباکتری گرمادوست که در رسوبات دریایی با دمای 100-90 درجه‌ی سلسیوس زندگی می‌کند، جدا گردیده است. این آنزیم، خصوصیت اگزونوکلئازی ۳ به ۵ را دارد که باعث اصلاح خطاهای ناشی از همانندسازی DNA می‌شود.روش‌ها: در این مطالعه، قطعه‌ی کد کننده‌ی ژن DNA پلیمراز Pfu در ناقل بیانی b15-pET کلون گردید. سپس با تغییر شرایط بیان مانند غلظت IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)، زمان و دمای القا، بیان این آنزیم بهینه شد. در نهایت در شرایط بهینه، پروتئین در مقیاس بالا تهیه و به روشی ساده تخلیص گردید. سپس آنزیم تخلیص شده، جهت بررسی فعالیت در واکنش PCR (Polymerase chain reaction) به کارگرفته شد.یافته‌ها: کلونی‌هایی بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب ایجاد شد که اکثر آن‌ها حاوی پلاسمید بودند. بیان آنزیم Pfu باندی را در حدود KD ۹۰ در ژل الکتروفورز SDS-PAGE (Sodium do decyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis) نتیجه داد. بیشترین میزان تولید پروتئین با غلظت ۷۵/۰ میلی‌مولار ماده‌ی القا کننده‌ی IPTG، دمای ۳۷ درجه‌ی سلسیوس و ۳ ساعت پس از القا مشاهده شد.نتیجه‌گیری: تخلیص پروتئین با به کارگیری روشی جدید بر مبنای پروتکل Desai منجر به ایجاد محصولی شد که در واکنش PCR فعالیتی مشابه با نمونه‌ی تجاری داشت. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Expression and Purification of Pfu DNA Polymerase Belonging to the B Family Polymerase

نویسندگان [English]

  • Mohammad-Reza Mofid 4
  • Daryoush Abedi 2
  • Mahdi Abbasian 3
1 PharmD Student, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Associate Professor, Department of Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Department of Agricultural Biotechnology, School of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran
4 Assistant Professor, Department of Biochemistry AND Bioinformatics Research Center, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Background: DNA polymerases are enzymes directing the synthesis of DNA molecules from deoxyribonucleotides. They are essential tools for molecular biology. Pfu DNA polymerase was initially isolated from Pyrococcus furiosus, anaerobic hyperthermophilic archaeon lived in geothermally heated marine sediments with temperatures between 90°C and 100°C. This enzyme possesses 3´ to 5´ exonucleotic activity; so that makes correcting the errors made in DNA replication.Methods: In this research, the DNA fragment encoding Pfu DNA polymerase was cloned in to pET-15b expression vector. Then, by changing expression conditions such as isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) concentration, and time and temperature of the induction, the expression of this enzyme was optimized. Finally, Pfu DNA polymerase was produced in large scale in optimized conditions and purified with simple method. Then, purified enzyme was used in polymerase chain reaction (PCR) for evaluating the activity.Findings: Transformation of recombinant vector produced some colonies that most of them have the plasmid. The expression of Pfu DNA polymerase resulted in a bond approximately 90 kDa in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Maximum amount of protein production was observed in IPTG concentration of 0.75 mM, at 37°C, 3 hours incubation.Conclusion: Protein purification with using the method based on Desai protocol caused a product that had the activity like commercial one in PCR reaction.

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA-dependent DNA polymerase
  • Polymerase chain reaction (PCR)
  • Cloning
  • pET-15b

مراجع

  1. Arezi B, Xing W, Sorge JA, Hogrefe HH. Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases. Anal Biochem 2003; 321(2): 226-35.
  2. Haki GD, Rakshit SK. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresour Technol 2003; 89(1): 17-34.
  3. Shekatkar S, Harish BN, Parija SC. Diagnosis of Leptospirosis by Polymerase. Chain Reaction. International Journal of Pharma and Bio Sciences 2010; 1(3): 1-6.
  4. Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T, et al. Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1. J Mol Biol 2001; 306(3): 469-77.
  5. Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, NY: Cold Spring Harbor laboratory Press; 2001.
  6. Kim DJ, Jang HJ, Pyun YR, Kim YS. Cloning, expression, and characterization of thermostable DNA polymerase from Thermoanaerobacter yonseiensis. J Biochem Mol Biol 2002; 35(3): 320-9.
  7. Wang Y, Prosen DE, Mei L, Sullivan JC, Finney M, Vander Horn PB. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res 2004; 32(3): 1197-207.
  8. Dietrich J, Schmitt P, Zieger M, Preve B, Rolland JL, Chaabihi H, et al. PCR performance of the highly thermostable proof-reading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi. FEMS Microbiol Lett 2002; 217(1): 89-94.
  9. Korolev S, Nayal M, Barnes WM, Cera ED, Waksman G. Crystal structure of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I at 2.5-A resolution: structural basis for thermostability. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(20): 9264-8.
  10. Ho DL, Byrnes WM, Ma WP, Shi Y, Callaway DJ, Bu Z. Structure-specific DNA-induced conformational changes in Taq polymerase revealed by small angle neutron scattering. J Biol Chem 2004; 279(37): 39146-54.
  11. McPherson MJ, McPherson SG. PCR. 1st ed. Philadelphia, PA: Taylor & Francis; 2000.
  12. Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Myambo K, Drummond R, Gelfand DH. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem 1989; 264(11): 6427-37.
  13. Kim SW, Kim DU, Kim JK, Kang LW, Cho HS. Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Int J Biol Macromol 2008; 42(4): 356-61.
  14. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge JA, Mathur EJ. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene 1991; 108(1): 1-6.
  15. Griffiths K, Nayak S, Park K, Mandelman D, Modrell B, Lee J, et al. New high fidelity polymerases from Thermococcus species. Protein Expr Purif 2007; 52(1): 19-30.
  16. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res 1996; 24(18): 3546-51.
  17. Mroczkowski BS, Huvar A, Lernhardt W, Misono K, Nielson K, Scott B. Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector. J Biol Chem 1994; 269(18): 13522-8.
  18. Lu C, Erickson HP. Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Protein Expr Purif 1997; 11(2): 179-84.
  19. Turner P, Mamo G, Karlsson EN. Potential and utilization of thermophiles and thermostable enzymes in biorefining. Microb Cell Fact 2007; 6: 9.
  20. Komori K, Ishino Y. Functional interdependence of DNA polymerizing and 3'-->5' exonucleolytic activities in Pyrococcus furiosus DNA polymerase I. Protein Eng 2000; 13(1): 41-7.
  21. Schut GJ, Brehm SD, Datta S, Adams MW. Whole-genome DNA microarray analysis of a hyperthermophile and an archaeon: Pyrococcus furiosus grown on carbohydrates or peptides. J Bacteriol 2003; 185(13): 3935-47.
  22. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 2006; 72(2): 211-22.
  23. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 1999; 10(5): 411-21.
  24. Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol 2005; 23(5): 567-75.
  25. Sorensen HP, Mortensen KK. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol 2005; 115(2): 113-28.
  26. Schumann W, Ferreira LCS. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genet Mol Biol 2004; 27(3): 442-53.
  27. Kilikian BV, Suarez ID, Liria CW, Gombert AK. Process strategies to improve heterologous protein production in Escherichia coli under lactose or IPTG induction. Process Biochemistry 2000; 35(9): 1019-25.
  28. Makino T, Skretas G, Georgiou G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microb Cell Fact 2011; 10: 32.
  29. Pan SH, Malcolm BA. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques 2000; 29(6): 1234-8.
  30. Desai UJ, Pfaffle PK. Single-step purification of a thermostable DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Biotechniques 1995; 19(5): 780-2, 784.
  31. Dabrowski S, Kur J. Cloning and expression in Escherichia coli of the recombinant his-tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei. Protein Expr Purif 1998; 14(1): 131-8.
  32. Kim Y, Babnigg G, Jedrzejczak R, Eschenfeldt WH, Li H, Maltseva N, et al. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods 2011; 55(1): 12-28.
  33. Cutler P. Protein Purification Protocols. New Mexico, US: Springer; 2004.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 31، شماره 251 - شماره پیاپی 251
مهر و آبان 1392
صفحه 1392-1404

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 05 تیر 1392
  • تاریخ بازنگری:
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار