جداسازی پلاسماسل از خون محیطی و هم‌کشتی با سلول استرومای مغز استخوان به منظور کشت طولانی مدت

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد، پژوهشکده‌ی علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران

2 استادیار، پژوهشکده‌ی علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران

3 استادیار، گروه ایمنی‌شناسی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: فن‌آوری تهیه‌ی آنتی ‌بادی بر پایه‌ی تک سلول B روشی‌ نوین در تهیه‌ی آنتی ‌بادی مونوکلونال انسانی محسوب می‌گردد. مهم‌ترین بخش‌ این فن‌آوری، کشت طولانی مدت پلاسماسل جدا شده از خون جهت ترشح آنتی ‌بادی است. با توجه به این که دلیل زنده ماندن طولانی مدت پلاسماسل‌ها در مغز استخوان حضور سیگنال‌های اطراف آن‌ها است، جهت کشت پلاسماسل در شرایط In vitro لازم است این سیگنال‌ها به واسطه‌ی حضور یک لایه سلول تغذیه‌ کننده تأمین شوند. به نظر می‌رسد که از میان انواع مختلف این سلول‌ها، سلول‌های استرومای مغز استخوان (BMSCs یا Bone marrow stromal cells) گزینه‌ی مناسب‌تری جهت هم‌کشتی با پلاسماسل محسوب می‌گردند. هدف از این پژوهش، جداسازی پلاسماسل‌های ترشح کننده‌ی آنتی ‌بادی از خون محیطی‌ و زنده نگهداشتن آن‌ها در شرایط In vitro می‌باشد.روش‌ها: پس از تزریق واکسن کزاز، تیتر آنتی ‌بادی در سرم خون افراد داوطلب با روش ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) اندازه‌گیری شد. PBMCs (Peripheral blood mononuclear cells) جدا شده از خون فرد ایمن با آنتی ‌بادی‌های رنگی اختصاصی سه نشانگر سطحی 45CD، 19CD و 38CD رنگ‌آمیزی شدند. پس از آن پلاسماسل‌ها به روش FACS (Fluorescence-activated cell sorting) از سایر جمعیت‌های سلولی موجود، جدا و در پلیت 96 خانه‌ای Sort شدند. سپس همراه با یک لایه BMSCs کشت داده شدند. پس از گذشت 10 روز، از پلاسماسل‌‌ها RNA استخراج شد و واکنش RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی ‌بادی انجام شد.یافته‌ها: روز ششم پس از واکسیناسیون، تیتر آنتی ‌بادی سرم، IU/ml 16 به دست آمد که نشان از پاسخ ایمنی بسیار مناسب در مقابل واکسن کزاز بود. همچنین، آنالیز فلوسایتومتری نمونه‌ی خون محیطی فرد ایمن شده در روز هفتم، درصد پلاسماسل موجود در PBMCs را حدود 3/0 درصد نشان داد. در نتیجه‌ی انجام واکنش RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی ‌بادی، قطعه‌ی VH (Variable heavy chain) به طول bp 400 تکثیر شد. این نتیجه، زنده بودن پلاسماسل‌ها و همچنین بیان ژن آنتی ‌بادی را در روز دهم در شرایط هم‌کشتی با BMSCs تأیید نمود.نتیجه‌گیری: حاصل این پژوهش، فراهم آوردن شرایط مناسب به منظور کشت پلاسماسل برای مدت 10 روز در محیط In vitro بود. بنابراین بخشی از فن‌آوری نوین تهیه‌ی آنتی ‌بادی بر پایه‌ی تک سلول B نیز پایه‌گذاری شد. نتایج به دست آمده در این پژوهش شامل درصد پلاسماسل موجود در PBMCs و اندازه‌ی قطعه‌ی ژنی VH تکثیر شده، با سایر مطالعات انجام شده در این زمینه مطابقت داشت. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation of Peripheral Blood Plasma Cells and Co-Culture with Bone Marrow Stromal Cells in Order to Long-Term Culture

نویسندگان [English]

  • Masoumeh Bazzaz 1
  • Jalil Fallah-Mehrabadi 2
  • Mahdi Mahdavi 3
  • Mahdi Zeinoddini 2
1 Biosciences and Biotechnology Research Center, Malek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran
2 Assistant Professor, Biosciences and Biotechnology Research Center, Malek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran
3 Assistant Professor, Department of Immunology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Single B cell antibody technology is a novel strategy to make human monoclonal antibody (mAb). Its main part is long-term culture of primary plasma cells (PC) to secrete antibody. PC survival in bone marrow is related to environmental signals, which should supply using a feeder cell monolayer during in-vitro culture of PCs. It seems that among different kinds of feeder cells, bone marrow stromal cells (BMSCs) are the best. The aim of this study was isolation of antibody secreting plasma cells from peripheral blood and surviving them during in-vitro culture.Methods: After tetanus vaccination, Ig concentrations of serum samples were titrated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. Isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of vaccinated donor were stained with three fluorescent anti CD38, anti CD19 and anti CD45 antibodies. Stained plasma cells were sorted into 96 wells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) and cultured with BMSCs as feeder cell. After 10 days, in order to determine plasma cell survival, total RNA were extracted from plasma cells and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method was performed using antibody specific primers.Findings: 7 days after vaccination, the serum antibody titration of donor was 16 IU/ml, which confirmed provoking a good immune response against tetanus vaccination. Flow analysis of peripheral blood sample on seventh day showed the presence of 0.3% plasma cells in PBMCs. Using RT-PCR with primers specific for antibody gene, the amplification of a variable heavy chain (VH) gene segment with the size of 400 bp was done; this confirmed the plasma cells survival and antibody gene expression during co-culture with BMSCs.Conclusion: The main result of this project was finding suitable pattern to isolate and survive plasma cells during 10 days in-vitro culture. Therefore, a part of single B cell antibody technology was established. Some of the results consist of percentage of plasma cells in PBMCs and the size of VH segment are in agreement with previous studies.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Human monoclonal antibody
  • Plasma cell
  • Bone marrow stromal cell
  • Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
  • Co-culture

مراجع

  1. Tiller T. Single B cell antibody technologies. N Biotechnol 2011; 28(5): 453-7.
  2. He XS, Sasaki S, Narvaez CF, Zhang C, Liu H, Woo JC, et al. Plasmablast-derived polyclonal antibody response after influenza vaccination. J Immunol Methods 2011; 365(1-2): 67-75.
  3. Chu VT, Beller A, Nguyen TT, Steinhauser G, Berek C. The long-term survival of plasma cells. Scand J Immunol 2011; 73(6): 508-11.
  4. Chu VT, Berek C. The establishment of the plasma cell survival niche in the bone marrow. Immunol Rev 2013; 251(1): 177-88.
  5. Burk KH, Drewinko B, Turjillo JM, Ahearn MJ. Establishment of a human plasma cell line in vitro. Cancer Res 1978; 38(8): 2508-13.
  6. Sabrina Y, Ali M, Nakano H. In vitro generation of anti-hepatitis B monoclonal antibodies from a single plasma cell using single-cell RT-PCR and cell-free protein synthesis. J Biosci Bioeng 2010; 109(1): 75-82.
  7. Moser K, Tokoyoda K, Radbruch A, MacLennan I, Manz RA. Stromal niches, plasma cell differentiation and survival. Curr Opin Immunol 2006; 18(3): 265-70.
  8. Minges Wols HA, Underhill GH, Kansas GS, Witte PL. The role of bone marrow-derived stromal cells in the maintenance of plasma cell longevity. J Immunol 2002; 169(8): 4213-21.
  9. Corti D, Voss J, Gamblin SJ, Codoni G, Macagno A, Jarrossay D, et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science 2011; 333(6044): 850-6.
  10. Chu VT, Berek C. Immunization induces activation of bone marrow eosinophils required for plasma cell survival. Eur J Immunol 2012; 42(1): 130-7.
  11. Perez LA, Woessner S, Sole F, Florensa L, Bonet C. Chromosomal and in vitro culture studies in a case of primary plasma cell leukemia. Cancer Genet Cytogenet 1994; 76(1): 36-8.
  12. Cassese G, Arce S, Hauser AE, Lehnert K, Moewes B, Mostarac M, et al. Plasma cell survival is mediated by synergistic effects of cytokines and adhesion-dependent signals. J Immunol 2003; 171(4): 1684-90.
  13. Meijer PJ, Nielsen LS, Allan JL. Human antibody repertoires. In: Dimitrov AS, editor. Therapeutic antibodies: methods and protocols. New York, NY: Human Press; 2009.
  14. Meijer PJ, Andersen PS, Haahr HM, Steinaa L, Jensen A, Lantto J, et al. Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing. J Mol Biol 2006; 358(3): 764-72.
  15. Lanzavecchia A, Corti D, Sallusto F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol 2007; 18(6): 523-8.
  16. Degrassi A, Hilbert DM, Rudikoff S, Anderson AO, Potter M, Coon HG. In vitro culture of primary plasmacytomas requires stromal cell feeder layers. Proc Natl Acad Sci U S A 1993; 90(5): 2060-4.
  17. Coronella JA, Telleman P, Truong TD, Ylera F, Junghans RP. Amplification of IgG VH and VL (Fab) from single human plasma cells and B cells. Nucleic Acids Res 2000; 28(20): E85.
  18. Wang X, Stollar BD. Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J Immunol Methods 2000; 244(1-2): 217-25.
  19. Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 2008; 329(1-2): 112-24.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 282 - شماره پیاپی 282
خرداد و تیر 1393
صفحه 534-543

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 19 دی 1392
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار