تشخیص انگل لیشمانیا در بیماران توسط کشت NNN و PCR-RFLP

‌هاشمی, نوشین; ‌هاشمی, میترا; اسلامی, گیلدا; شیرانی بید آبادی, لیلا; حجازی, سیدحسین

تشخیص انگل لیشمانیا در بیماران توسط کشت NNN و PCR-RFLP

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

¹ کارشناس ارشد، گروه انگل‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی خراسان شمالی، بجنورد، ایران

² کارشناس ارشد، گروه آمار، معاونت آموزشی، دانشگاه علوم پزشکی خراسان شمالی، بجنورد، ایران

³ استادیار، گروه انگل و قارچ‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی یزد، یزد، ایران

⁴ کارشناس ارشد، گروه حشره‌شناسی، مرکز تحقیقات پوست و سالک، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

⁵ دانشیار، گروه انگل و قارچ‌شناسی، دانشکدهی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: لیشمانیوز یک بیماری عفونی انگلی با انتشار وسیع در مناطق معتدله و گرمسیری است. هدف این مطالعه به کار گیری دو روش PCR-RFLP و کشت NNN (Novy-Nicol-Mac Nea) در نمونه‌هایی بود که اسمیر مستقیم آن‌ها از نظر وجود آماستیگوت منفی بود.روش‌ها: این مطالعه جهت بررسی و تعیین گونه‌های Leishmania در منطقه‌ی اصفهان بر روی DNA استخراج شده از انگل‌های حاصل از کشت بیماران اسمیر منفی با روش PCR-RFLP (Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) انجام شد. جهت کشت انگل مقداری ا ز نمونه‌ی برداشت شده از بیمار بر روی محیط NNN و RPMI 1640 برده شد. از مجموع 100 نمونه اسمیر منفی 50 نمونه در محیط کشت از نظر پزوماستیگوت‌های انگل Leishmania مثبت شد و DNA حاصل از کشت نمونه‌ها استخراج گردید. بعد از استخراج DNA با استفاده از روشPCR-RFLP تکثیر از توالی ITS1با پرایمرهای اختصاصی صورت گرفت و بعد از هضم با آنزیم HaeIII ایزوله‌ها در مقایسه با سویه‌های استاندارد تعیین گونه شدند.یافته‌ها: از مجموع 50 نمونه‌ی اصفهان 46 نمونه L.major و 4 نمونه L.tropica تشخیص داده شد.نتیجه‌گیری: مطالعه‌ی حاضر نشان داد که PCR-RFLP روشی حساس و دقیق برای تعیین گونه‌های عامل لیشمانیوز جلدی است و ضایعات مورد مطالعه در منطقه‌ی اصفهان ناشی از L.major و L.tropica می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Detection of Leishmania Parasites from Cutaneous Leishmaniasis Patients with Negative Direct Microscopy using NNN and PCR-RFLP

نویسندگان [English]

Noushin Hashemi ¹
Mitra Hashemi ²
Guilda Eslami ³
Leila Shirani Bidabadi ⁴
Seyed Hossein Hejazi ⁵

¹ Department of Medical Mycology, School of Medicine, North Khorasan University of Medical Sciences, Bojnourd, Iran

² Department of Statistics, Vice-Chancellery for Education, North Khorasan University of Medical Sciences, Bojnourd, Iran

³ Assistant Professor, Department of Medical Mycology, School of Medicine, Yazd University of Medical Sciences, Yazd, Iran

⁴ Department of Medical Entomology, Skin Diseases and Leishmaniasis Research Center, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

⁵ Associate Professor, Department of Medical Mycology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

چکیده [English]

Background: Leishmaniasis is a parasitic infectious disease caused by a protozoan parasite from trypanosomatidae family with a wide spectrum in tropical and subtropical areas. The purpose of the study was to characterize various species of Leishmania isolates from Isfahan, Iran with negative direct smears.Methods: This study used culture methods and PCR-RFLP to detect cutaneous leishmaniasis (CL) in patients who referred to the Center for Research in Skin Disease and Leishmaniasis, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan Iran, with negative direct smears. Samples taken from the lesions of patients were cultured on NNN and RPMI1640 mediums. Out of 100 smear negative samples, 50 turned positive for leishmania promastigotes whose DNA was extracted. The amplified ITS1 region of DNA was then analyzed through PCR-RFLP. After digesting the isolates by HaeIII enzyme, the species were determined according to standard strains.Findings: Among 50 isolates from Isfahan region, 46 isolates were identified as L. major and 4 as L. tropica. Conclusion: The present research showed that PCR-RFLP is an accurate method for specifying agent species of CL. It was also found that L. major and L. tropica were the main two species responsible for various kinds of skin involvement in the region.

کلیدواژه‌ها [English]

PCR-RFLP
Cutaneous leishmaniasis
Isfahan
Parasite

مراجع

Schlein Y, Warburg A, Schnur LF, Gunders AE. Leishmaniasis in the Jordan Valley II. Sandflies and transmission in the central endemic area. Trans R Soc Trop Med Hyg 1982; 76(5): 582-6.
Minodier PH, Parola PH. Cutaneous leishmaniasis treatment. Travel Medicine and Infectious Disease 2007; 5(3): 150-8.
Oumeish OY. Cutaneous leishmaniasis: a historical perspective. Clin Dermatol 1999; 17(3): 249-54.
Bailey MS, Lockwood DNJ. Cutaneous leishmaniasis. Clinics in Dermatology 2007; 25(2): 203-11.
Control of the leishmaniases. Report of a WHO Expert Committee. World Health Organ Tech Rep Ser 1990; 793: 1-158.
The leishmaniasis. World Health Organization, Technical ReportSeries 1984; 701: 2-4.
Desjeux P. Leishmaniasis. Public health aspects and control. Clin Dermatol 1996; 14(5): 417-23.
Tashakori M, Ajdary S, Kariminia A, Mahboudiand F, Alimohammadian MH. Characterization of Leishmania Species and L. major Strains in Different Endemic Areas of Cutaneous Leishmaniasis in Iran. Iranian Biomedical Journal 2003; 7(2): 43-50.
Tashakori M, Kuhls K, Al-Jawabreh A, Mauricio IL, Schonian G, Farajnia S, et al. Leishmania major: genetic heterogeneity of Iranian isolates by single-strand conformation polymorphism and sequence analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer. Acta Trop 2006; 98(1): 52-8.
Hagardson K. Comparison of DNA isolation methods to detect Leishmania parasites in blood samples. Athens: Uppsala University; 2006.
Yang ZH, Huang J, Yao Y. Autoscreening of Restriction Endonucleases for PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Identification of Fungal Species, with Pleurotus spp. as an Example. Appl Environ Microbiol 2007; 73(24): 7947-58.
Rotureau B, Ravel C, Couppie P, Pratlong F, Nacher M, Dedet JP, et al. Use of PCR-restriction fragment length polymorphism analysis to identify the main new world Leishmania species and analyze their taxonomic properties and polymorphism by application of the assay to clinical samples. J Clin Microbiol 2006; 44(2): 459-67.
Berman JD. Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin Infect Dis 1997; 24(4): 684-703.
Tai NOE, Osman OF, Fari ME, Presber W, Schönian G. Genetic heterogeneity of ribosomal internal transcribed spacer in clinical samples of Leishmania donovani spotted on filter paper as revealed by single-strand conformation polymorphisms and sequencing. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2000; 94(5): 575-9.
Marfurt J, Nasereddin A, Niederwieser I, Jaffe CL, Beck HP, Felger I. Identification and differentiation of Leishmania species in clinical samples by PCR amplification of the miniexon sequence and subsequent restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol 2003; 41(7): 3147-53.
Singh S, Sivakumar R. Recent advances in the diagnosis of leishmaniasis. J Postgrad Med 2003; 49(1): 55-60.
Vega-Lopez F. Diagnosis of cutaneous leishmaniasis. Curr Opin Infect Dis 2003; 16(2): 97-101.
Azani S, Rasi Y, Oshaghi MA, Ershadi MR, Mohebali M, Abaei MR, et al. Diagnosis and characterization of leishmania species in patients and rodents giemsa-stained slides by PCR-RFLP in damghan district, iran. Scientific Journal of Hamadan University of Medical Sciences and Health Services Winter 2011; 17(4): 5-9.
Bensoussan E, Nasereddin A, Jonas F, Schnur LF, Jaffe CL. Comparison of PCR assays for diagnosis of cutaneous leishmaniasis. J Clin Microbiol 2006 Apr; 44(4): 1435-9.
Motazedian M. Study of glucantime resistance in cutaneous leishmaniasis by PCR-RFLP method in Shiraz, Iran. 2004.
Kazemi–Rad E, Mohebali M , Hajjaran E, Rezaei S, Mamishi S. Diagnosis and characterization of leishmania species in giemsa–stains lides by PCR-RFLP. Iranian J Publ Health 2008; 37(1): 54-60.