مقایسه‌ی روش‌های کشت میکروبی و PCR در تعیین آلودگی رده‌های سلولی به مایکوپلاسما

عربستانی, محمد رضا; فاضلی, حسین; جدی تهرانی, محمود; شکری, فاضل

مقایسه‌ی روش‌های کشت میکروبی و PCR در تعیین آلودگی رده‌های سلولی به مایکوپلاسما

نوع مقاله : Original Article(s)

نویسندگان

¹ دانشجوی دکتری، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

² استادیار، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

³ استاد، گروه ایمنی شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

⁴ استاد، گروه ایمنی شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: مایکوپلاسماها از آلوده کنندگان اصلی رده‌های سلولی هستند که به عنوان مشکل عمده‌ی اقتصادی و بیولوژیکی در زمینه‌های تحقیقات پایه تشخیص و فرآورده‌های بیوتکنولوژی در نظر گرفته می‌شود. تشخیص مایکوپلاسما در کشت‌های سلولی ابتدا به وسیله‌ی کشت میکروبی آغاز شد و سپس رنگ آمیزی DAPI و آزمایش‌های سرولوژی از قبیل آزمایش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم، آزمایش DNAprobe، PCR-ELISA، PCR و Real-Time PCR برای شناسایی مایکوپلاسما توسعه یافت.روش‌ها: در این مطالعه، یک روش سریع حساس اختصاصی برای تشخیص گونه‌های مختلف مایکوپلاسما در کشت‌های سلولی مورد استفاده قرار گرفت. این روش بر اساس واکنش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جنس 11 گونه‌ی مختلف مایکوپلاسما انجام گرفت.یافته‌ها: از 183 رده‌ی سلولی مختلف موجود در بانک سلولی مورد بررسی با روش PCR 6/48 درصد رده‌های سلولی آلودگی به مایکوپلاسما را نشان داد؛ در حالی که با روش کشت میکروبی 3/27 درصد از رده‌های سلولی آلودگی به مایکوپلاسما را نشان دادند. نتایج به دست آمده توسط روش PCR در مقایسه با روش کشت میکروبی حساسیت 100 درصد و ویژگی 7/70 درصد را نشان داد.نتیجه‌گیری: نتایج به دست آمده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی گونه‌های مختلف مایکوپلاسما نشان داد که مهم‌ترین و عمده‌ترین گونه‌های آلوده کننده‌ی رده‌های سلولی به ترتیب اهمیت آلودگی شامل مایکوپلاسما فرمانتانس، مایکوپلاسما آرجینینی، مایکوپلاسما هیوراینیس و مایکوپلاسما اورال بودند. این مطالعه همچنین نشان داد که برخی از رده‌های سلولی با بیش از یک گونه مایکوپلاسما آلوده بودند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The Comparison of Microbial Culture and PCR Methods in Detection Of Cell Line To Mycoplasma

نویسندگان [English]

Mohammad Reza Arabestani ¹
Hossain Fazeli ²
Mahmmud Jedi Tehrani ³
Fazel Shokri ⁴

¹ PhD Student, Department of Microbiology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

² Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

³ Professor, Department of Immunology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran

⁴ Professor, Department of Immunology, School of Medicine, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran

چکیده [English]

Background: Mycoplasma is a major contaminant of cell lines and is cosiderd as a serious problem of economic and biological importance in basic research, diagnosis, and biotechnology products. Detection of mycoplasma infection in cell cultures started on microbiological culture; later, other methods like DAPI staining and serological tests such as Indirect Immunofluorescnse, ELISA, DNA probe, PCR, PCR-ELISA, and Real-Timr PCR developed for detection of mycoplasma.Methods: In this study, a sensitive, specific, and rapid method was used for detection of varity of mycoplasma species in cell lines. This method was based on a PCR reaction using genus specific primers for 11 mycoplasma species.Results: Mycoplasma contamination using this assay was examind for 183 different cell line deposited in national cell bank of Iran. PCR showed that 48.6% of cell lines were contaminated with mycoplasma while 27.3% of them were found to be infected. In comparison to microbiological culture, PCR method was shown to be 100% sensitive and 70.7% specific.Conclusion: Our results using species specific primers reveald that the most important contaminating mycoplasma species in cell lines were mycoplasma fermentans, mycoplasma arginini, mycoplasma hyorhinis, and mycoplasma orale. We were also able to identify a number of cell lines which were contaminated whit more than one species of mycoplasma.

کلیدواژه‌ها [English]

Mycoplasma
Cell lines
Microbiological culture
PCR

مراجع

Hay RJ, Macy ML, Chen TR. Mycoplasma infection of cultured cells. Nature 1989; 339(6224): 487-488.
Tully JG. Mollicutes In: Encylopedia of Microbiology Vol3. San Diego: Academic press, 1992.
Bolske G. Survey of Mycoplasma infections in cell cultures and a comparison of detection methods. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A 1988; 269(3): 331-40.
Pawar V, Luczak J, Cox MS, Dubose J, Harbell JW. Trends in the incidence and distribution of mycoplasma contamination detected in cell lines and their products. Int Organ Mycoplasma Lett, 1994.
Polak-Vogelzang AA, Brugman J, Reijgers R. Comparison of two methods for detection of mollicutes (Mycoplasmatales and Acholeplasmatales) in cell cultures in the Netherlands. Antonie Van Leeuwenhoek 1987; 53(2): 107-18.
Uphoff CC, Brauer S, Grunicke D, Gignac SM, MacLeod RA, Quentmeier H, et al. Sensitivity and specificity of five different mycoplasma detection assays. Leukemia 1992; 6(4): 335-41.
Arai S, Harasawa R, Ohno T, Takeuchi M, Lee I, Kato K, et al. Comparative studies to detect mycoplasma Contamination in biondustrial for validating standard method. Int Organ Mycoplasma Lett 1994; 3: 48-9.
Mc Garrity GJ, Kotani H, Butler GH. Mycoplasmas and Tissue Culture Cells. Mycoplasmas biology and pathogenesis. Washgington DC: American Society for Microbiology, 1992: 445-54.
McGarrity GJ, Kotani H, Carson D. Comparative studies to determine the fficiency of 6 methylpurine deoxyriboside to detect cell culture mycoplasmas. In Vitro Cell Dev Biol 1986; 22(6): 301-4.
Somerson NL, Cole BC. The mycoplasma flora of human and nonhuman primates. New York: The Mycoplasmas. Academic press, 1979.
Barile MF, Rottem S. Mycoplasma in cell structures. In: Kahane I, Adoni A, editors. Rapid diagnosis of mycoplasmas. New York: Plenum Press, 1993: 155-93.
Dussurget O, Roulland-Dussoix D. Rapid, sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sera. Appl Environ Microbiol 1994; 60(3): 953-9.
Rawadi G, Lecaque D, Pirot D, Roman-Roman S. Detection and identification of mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction. Methods Mol Cell Biol 1993; 4: 147-56.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Volume Set). 2nd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
(Manfred W, Memrtina G, Hansjorg H. Mycoplsma detection by the mycoplasma PCR-ELISA . Biotech, 1995.
Uphoff CC, Drexler HG. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2002; 38(2): 79-85.