افزایش پوشش پروتئوم سلول‌های Hs578T، متعلق به سرطان پستان، در نمایه‌ی الکتروفورز دو بعدی با حذف کارآمد مداخله‌گرهای غیر پروتئینی

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده‌‌‌ی‌ پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

2 استادیار، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، دانشکده‌‌ی پیراپزشکی، تهران، ایران

3 دانشجوی کارشناسی‌ ارشد، کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده‌‌‌ی‌ پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

4 استاد، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده‌‌‌ی‌ پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

5 دانشیار، مرکز تحقیقات ایمونولوژی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: با وجود استفاده‌ی گسترده، پوشش پروتئینی پایین و الگوهای اسمیری، از مهم‌ترین موانع بازدارنده برای استفاده از مطالعات پروتئومیک مبتنی بر ژل در بررسی‌های بالینی می‌باشد. بنابراین، در این مطالعه تلاش شد تا پوشش نمایه‌ی دو بعدی پروتئوم رده‌ی سلولی Hs578T، متعلق به سرطان پستان افزایش یابد و تأثیر کارآمدی روش‌های مرسوم حذف مداخله‌گرهای غیر پروتئینی در افزایش تعداد پروتئین‌ها در نمایه‌ی دو بعدی ارزیابی گردد.روش‌ها: سلول‌های رده‌ی Hs578T، به منظور استخراج عصاره‌ی خام سلولی، در بافر لیز مناسب تیمار شدند. عصاره‌های سلولی حاصل از استخراج‌های متعدد، با هم همگن و در حجم‌های یکسان تقسیم شدند و در سه تکرار، با روش‌های استون، استون- متانول و تری‌کلرواستیک اسید (Trichloroacetic acid یا TCA)- استون خالص گشتند. سپس، پروتئوم خالص تهیه شده از هر روش، در یک بافر بازآب‌رسانی استاندارد حل شد و بر روی نوارهای Immobilized pH gradient (IPG) 17 سانتی‌متری بارگذاری گشت. پس از تفکیک ایزوالکتریک در بعد اول، محتوای پروتئوم، یک ‌بار دیگر در سیستم الکتروفورز O'Farrell نیز مورد تفکیک الکتروفورتیک قرار گرفت. در نهایت، پس از ظهور نقاط پروتئینی در نمایه‌ی دو بعدی، تصاویر حاصل با استفاده از نرم‌افزار ImageMaster به ‌صورت کمی- کیفی تحلیل شدند.یافته‌ها: بازده‌ بازیابی پروتئوم، برای روش‌های استون، استون- متانول و TCA- استون به‌ ترتیب 001/0 ± 100/0، 002/0 ± 070/0 و 005/0 ± 120/0 نانوگرم به ازای هر سلول محاسبه شد. آنالیز تصویر نیز حضور 9 ± 1299 نقطه‌ی پروتئینی را در نمایه‌‌ی دو بعدی تخلیص‌ شده با استون نشان داد که این تعداد برای تخلیص با استون- متانول و TCA- استون به ترتیب 14 ± 1698 و 17 ± 1973 بود. نتایج از سه اندازه‌گیری جداگانه به دست آمد.نتیجه‌گیری: آماده‌سازی نمونه‌ها با روش TCA- استون، نه تنها بالاترین بازده ‌بازیابی پروتئین را دارد؛ بلکه، پوشش پروتئومی بهتری را نیز ارایه می‌دهد. بنابراین، این روش برای مطالعات پروتئومیک مقایسه‌ای توصیه می‌گردد. با این وجود، تخلیص با استون- متانول، با توجه به ارایه‌ی نقاط پروتئینی قوی‌تر، برای مطالعات سرولوژیکی پروتئوم پیشنهاد می‌گردد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Improving Proteome Coverage for Hs578T Breast Cancer Cell-Line due to Efficient Interfering Removal

نویسندگان [English]

  • Hamidreza Abbasi 1
  • Neda Saraygord-Afshari 2
  • Neda Mohammadi 3
  • Mohammad Morad Farajollahi 4
  • Reza Falak 5
1 Department of Medical Biotechnology, School of Allied Medical Sciences, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
2 Assistant Professor; Department of Medical Biotechnology, School of Allied Medical Sciences, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 MSc Student, Student Research Committee, Department of Medical Biotechnology, School of Allied Medical Sciences, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4 Professor, Department of Medical Biotechnology, School of Allied Medical Sciences, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
5 Associate Professor, Immunology Research Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: In spite of the wide use, low proteome coverage and fuzzy patterns are the most important deterrents for the clinical applications of gel-based proteomic studies. So herein, we tried to increase the 2-dimentional proteome coverage of Hs578T breast cancer cells via investigating the efficacy of the three common techniques, usually used for interfering removal.Methods: Hs578T cells were incubated in a lysis solution to obtain raw cell extracts. Cellular soups of each extraction were then pooled, homogenized, and aliquoted to be further treated by three different protein-specific purification methods including acetone, acetone-methanol, and trichloroacetic acid (TCA)-acetone, each in triplicates. All the purified protein pellets were then dissolved in a standard rehydration buffer solution, loaded into the 17-cm immobilized pH gradient (IPG) strips, and separated according to their isoelectric points. Proteins were then separated once more according to their molecular weights in an O'Farrell separation system. Finally, by the visualization of the protein spots on the 2-dimentional profiles, quality and quantity of these 2-dimentional proteome patterns were then analyzed using the ImageMaster software.Findings: The obtained proteome recovery yields and total protein counts for acetone, acetone-methanol, and trichloroacetic acid-acetone methods were 0.100 ± 0.001, 0.070 ± 0.002, and 0.120 ± 0.005 ng/cell, and 1299 ± 9, 1698 ± 14 and 1973 ± 17, respectively. The results represent data obtained from three independent experiments.Conclusion: Trichloroacetic acid-acetone purification not only represented the highest recovery yield, suitable for expensive assays, but also showed the most suitable proteome coverage. So, the method is recommended for the comparative proteomic studies. However, the acetone-methanol procedure is more recommended for serological proteome analysis (SERPA); since it represents stronger protein spots which are more fitted to the immunoblotting procedure.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Proteome
  • Purification
  • Two-dimensional gel electrophoresis
  • Cell line
  • Brest cancer

مراجع

  1. Witzmann FA, Grant RA. Pharmacoproteomics in drug development. Pharmacogenomics J 2003; 3(2): 69-76.
  2. Saraygord-Afshari N, Naderi-Manesh H, Naderi M. Enhanced reproducibility of the human gel-based tear proteome maps in the presence of di-(2-hydroxyethyl) disulfide. Biotechnol Appl Biochem 2014; 61(6): 660-7.
  3. Magdeldin S, Enany S, Yoshida Y, Xu B, Zhang Y, Zureena Z, et al. Basics and recent advances of two dimensional- polyacrylamide gel electrophoresis. Clin Proteomics 2014; 11(1): 16.
  4. Rabilloud T. Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis. An outline. Methods Mol Biol 1999; 112: 9-19.
  5. Rabilloud T. Solubilization of proteins for electrophoretic analyses. Electrophoresis 1996; 17(5): 813-29.
  6. Hao R, Adoligbe C, Jiang B, Zhao X, Gui L, Qu K, et al. An optimized trichloroacetic acid/acetone precipitation method for two-dimensional gel electrophoresis analysis of qinchuan cattle longissimus dorsi muscle containing high proportion of marbling. PLoS One 2015; 10(4): e0124723.
  7. Berkelman T. Removal of interfering substances in samples prepared for two-dimensional (2-D) electrophoresis. In: Posch A, editor. 2D PAGE: Sample preparation and fractionation. Totowa, NJ: Humana Press; 2008. p. 51-62.
  8. Nejadi N, Mohammadpoor Masti S, Rezaei Tavirani M, Golmohammadi T. Comparison of three routine protein precipitation methods: Acetone, TCA/acetone wash and TCA/acetone. J Paramed Sci 2014; 5(4); 58-60.
  9. Jiang L, He L, Fountoulakis M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. J Chromatogr A 2004; 1023(2): 317-20.
  10. Fic E, Kedracka-Krok S, Jankowska U, Pirog A, Dziedzicka-Wasylewska M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis 2010; 31(21): 3573-9.
  11. Saraygord-Afshari N, Naderi-Manesh H, Naderi M. Increasing proteome coverage for gel-based human tear proteome maps: Towards a more comprehensive profiling. Biomed Chromatogr 2015; 29(7): 1056-67.
  12. Butler M. Animal cell culture and technology. Abingdon, UK: Taylor and Francis; 2003.
  13. Westermeier R, Naven T. Proteomics in practice: A Laboratory manual of proteome analysis. Hoboken, NJ: Wiley; 2002.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 36، شماره 471 - شماره پیاپی 471
فروردین و اردیبهشت 1397
صفحه 216-220

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 04 بهمن 1396
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار