بیان پروانسولین انسانی در گیاه با استفاده از ناقل pVUT (Plasmid Viral University of Tehran)

نوع مقاله : Original Article(s)

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

2 استاد، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

3 استادیار، مرکز تحقیقات بیماری‌های ارثی کودکان، پژوهشکده‌ی پیشگیری اولیه از بیماری‌های غیرواگیر و گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 دانشجوی دکتری، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

5 استادیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: انسولین هورمون پروتئینی است که توسط سلول‌های بتای پانکراس ترشح می‌شود. به علت معایب تولید پروتئین‌های نوترکیب در میکروارگانیسم‌ها، هزینه به نسبت بالا، امکان آلودگی با پروتئین‌های سمی و مراحل هزینه‌بر خالص‌سازی، تولید پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان امری قابل بررسی است. توسعه‌ی سیستم بیان گذرا بر پایه‌ی نوع حذف شده‌ی RNA-2 ویروس موزائیک لوبیا چشم بلبلی (Cowpea Mosaic Virus-Hyper Translatable یا CPMV-HT)، امکان تولید سریع و سطوح بالای پروتئین‌ها را بدون استفاده از همانندسازی ویروسی فراهم کرده است.روش‌ها: در این مطالعه، سازه‌های pBI121-Proinsulin-Zera (pBI-ProZ) در بر دارنده‌ی توالی ژن پروانسولین انسانی و Zera (دومین انتهای N غنی از پرولین گاما- زئین ذرت) و pCAMBIA1304-Proinsulin-Extensin (pCAMBIA-ProE) در بر دارنده‌ی سیستم بیانی CPMV-HT، به منظور بهبود ترجمه‌ی ژن پروانسولین انسانی و توالی سیگنال پپتید اکستنسین هویج ساخته شد. این دو سازه، به واسطه‌ی باکتری Agrobacterium tumefaciens pv. C58، به صورت بیان گذرا به گیاهان کاهو و یونجه انتقال داده شدند. تحلیل آماری این پژوهش بر پایه‌ی آزمایش فاکتوریل، در قالب طرح به‌کلی تصادفی بر روی غلظت پروانسولین تولیدی در هر گرم برگ تراریخت صورت گرفت. بیان ژن پروانسولین در بافت گیاهی تراریخت در سطح رونویسی، با استفاده از واکنش Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) و در سطح ترجمه، با استفاده از آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای و Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) مورد تأیید قرار گرفت.یافته‌ها: میزان پروانسولین فعال تولیدی با سازه‌های pCAMBIA-ProE و pBI-ProZ، در برگ‌های یونجه تراریخت، به ترتیب 82/6 و 32/4 نانوگرم در هر گرم برگ تر و در برگ‌های کاهوی تراریخت، به ترتیب 6/6 و 8/3 نانوگرم در هر گرم برگ تر بود.نتیجه‌گیری: طبق نتایج به دست آمده از این تحقیق، میزان بیان پروتئین پروانسولین در سازه‌ی pCAMBIA-ProE در بر دارنده‌ی خصوصیات سیستم بیانی CPMV-HT، بیشتر از سازه‌ی pBI-ProZ بود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Plant Expression of Human Proinsulin Using the Plasmid Viral University of Tehran (pVUT) Vector

نویسندگان [English]

  • Mahnaz Kheirollahi 1
  • Ali Akbar Shahnejat-Bushehri 2
  • Majid Kheirollahi 3
  • Fariba Abooei-Mehrizi 4
  • Hooshang Alizadeh 5
1 MSc Student, Department of Agronomy and Plant Breeding, School of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
2 Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, School of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
3 Assistant Professor, Pediatric Inherited Diseases Research Center, Research Institute for Primordial Prevention of Non-communicable Disease AND Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University Of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4 PhD Student, Department of Agronomy and Plant Breeding, School of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
5 Assistant Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, School of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
چکیده [English]

Background: Insulin is a hormone exclusively produced by pancreatic beta cells. The production of recombinant proteins in microorganisms has some disadvantages such as high cost, the possibility of contamination with toxic proteins, and costly purification steps; so, the production of recombinant proteins in plants can be investigated. Development of transient expression system based on a deleted version of Cowpea mosaic virus RNA-2, Cowpea Mosaic Virus-Hyper Translatable (CPMV-HT), has provided the extremely high-level and rapid production of proteins without viral replication.Methods: In this study, two constructions were prepared; pBI121-Proinsulin-Zera (pBI-ProZ) containing human proinsulin gene and Zera (N-terminal proline-rich domain of γ-zein) and pCAMBIA1304-Proinsulin-Extensin (pCAMBIA-ProE) containing CPMV-HT expression system for improvement of translation of human proinsulin gene and carrot extensin signal peptide. Both structures were transiently transferred in to lettuce and alfalfa leaves using Agrobacterium tumefasiens pv. C58. Statistical analysis of this study was conducted on the concentration of produced proinsulin per each gram of transgenic leaf using factorial arrangement of treatment in a complete randomized design. Gene expression was confirmed in transcription level using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method and in translation level using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Dot blot assay.Findings: Protein accumulation for pCAMBIA-ProE and pBI-ProZ constructs were 6.82 and 4.32 ng/g in recombinant alfalfa leaves and 6.6 and 3.8 ng/g in recombinant lettuce leaves, respectively.Conclusion: Results showed that the expression of proinsulin in pCAMBIA-ProE contains CPMV-HT expression system was more than pBI-ProZ.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Human proinsulin gene
  • Transient expression
  • Cowpea Mosaic Virus-Hyper Translatable (CPMV-HT) expression system
  • Transgenic plant tissue

مراجع

  1. Boyhan D, Daniell H. Low-cost production of proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectable or oral delivery of functional insulin and C-peptide. Plant Biotechnol J 2011; 9(5): 585-98.
  2. Fischer R, Stoger E, Schillberg S, Christou P, Twyman RM. Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol 2004; 7(2): 152-8.
  3. Twyman RM, Stoger E, Schillberg S, Christou P, Fischer R. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends Biotechnol 2003; 21(12): 570-8.
  4. Chen Q, Lai H, Hurtado J, Stahnke J, Leuzinger K, Dent M. Agroinfiltration as an Effective and Scalable Strategy of Gene Delivery for Production of Pharmaceutical Proteins. Adv Tech Biol Med 2013; 1(1).
  5. Canizares MC, Nicholson L, Lomonossoff GP. Use of viral vectors for vaccine production in plants. Immunol Cell Biol 2005; 83(3): 263-70.
  6. Sainsbury F, Thuenemann EC, Lomonossoff GP. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnol J 2009; 7(7): 682-93.
  7. Fischer R, Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic Res 2000; 9(4-5): 279-99.
  8. Sainsbury F, Lomonossoff GP. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiol 2008; 148(3): 1212-8.
  9. Khoudi H, Laberge S, Ferullo JM, Bazin R, Darveau A, Castonguay Y, et al. Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. Biotechnol Bioeng 1999; 64(2): 135-43.
  10. Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M, Pniewski T, Letellier M, Lisowa O, et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J 1999; 13(13): 1796-9.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 33، شماره 327 - شماره پیاپی 327
فروردین و اردیبهشت 1394
صفحه 346-354

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 14 فروردین 1394
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار