کلون و بیان مولکولی ژن رتپلاز در سلول‌های باکتری اشریشیا کولی با استفاده از پروموتر tac

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای داروسازی، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 استاد، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

3 استادیار، گروه زیست‌شناسی، دانشکده‌ی علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: این مطالعه با هدف کلون و بیان cDNA رتپلاز، داروی ترومبولیتیک مورد استفاده در درمان انفارکتوس میوکارد و سکته‌ی مغزی، و با کنترل پروموتر tac در سلول‌های E. Coli (Escherichia coli) طراحی شد. روش‌ها: ژن رتپلاز با استفاده از پرایمرهای مناسب و طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction یا PCR) تکثیر شد. محصول به دست‌آمده در پلاسمید pTZ57R کلون گردید. DNA به دست ‌آمده توسط آنزیم‌های محدودکننده برش داده شد و به درون وکتور بیانی pGEX-5x-1 وارد گردید. وجود قطعه‌ی واردشده در وکتور بیانی با کمک هضم آنزیمی و تعیین توالی نوکلئوتیدی تأیید شد. بیان رتپلاز موجود در سلول‌های E. Coli TOP10 با استفاده از افزودن غلظت‌‌های 2/0، 5/0 و 1 میکرومول از IPTG (Isopropyl beta-D thiogalactopyranoside) القا شد و سپس تحت آنالیز با SDS-PAGE قرار گرفت. یافته‌ها: الکتروفورز محصول PCR و همچنین هضم آنزیمی پلاسمید pTZ57R نوترکیب، باند 1068 جفت بازی رتپلاز را نشان داد. آنالیز SDS-PAGE نشان ‌دهنده‌ی یک باند پروتئین 60 کیلودالتونی بود که در اثر القای بیان با IPTG تولید شده بود. نتیجه‌گیری: در این مطالعه cDNA رتپلاز با استفاده از پروموتر tac در سلول‌های E. Coli به طور موفقیت‌آمیزی کلون و بیان شد. واژگان کلیدی: رتپلاز، t-PA، پروموتر tac، کلون کردن، اشرشیا کلی

عنوان مقاله [English]

Molecular Cloning and Expression of Reteplase in Escherichia Coli Using tac Promoter

نویسندگان [English]

  • Safieh Aghabdollahian 1
  • Mohammad Rabbani 2
  • Kamran Ghaedi 3
  • Hamid Mir Mohammad Sadeghi 2
1 Pharm D Student, Department of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Professor, Department of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Assistant Professor, Department of Biology, School of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Background: This study was aimed to clone and express the reteplase complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), a thrombolytic agent used for the treatment of acute myocardial infarction and stroke, in escherichia coli using tac promoter. Methods: Reteplase cDNA was amplified using polymerase chain reaction (PCR) with designed primers. The product was then cloned into pTZ57 plasmid. The cloned DNA was digested out and ligated into pGEX-5x-1 expression vector. The presence of the insert was confirmed by restriction digestion and determination of the nucleotide sequence. By using 0.2, 0.5, and 1 mM isopropyl beta-D thiogalactopyranoside (IPTG), reteplase was induced in escherichia coli TOP10 cells and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Findings: Electrophoresis of PCR product as well as double digested recombinant pTZ57 plasmid showed a 1068 base pair band of reteplase. SDS-PAGE analysis showed a 60 kilodalton band of protein product induced by IPTG. Conclusion: In the present study, reteplase cDNA was successfully cloned and expressed using tac promoter. This vector was used for the optimization of the expression of reteplase in escherichia coli. Keywords: Reteplase, Tissue plasminogen activator, Genetic promoter regions, Molecular cloning, Escherichia coli

مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 30، شماره 213 - شماره پیاپی 213
آذر و دی 1391
صفحه 1911-1918

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 28 مرداد 1391
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار