مقایسه‌ی ویژگی‌های سلول‌های استئوبلاست انسانی در دو روش کشت تک لایه‌ای و کشت سه بعدی هیدروکسی آپاتیت- تری‌کلسیم فسفات

نوع مقاله : Original Article(s)

نویسندگان

1 استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران.

2 دانشجوی دکتری، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.

3 کارشناس ارشد، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 استاد، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

5 دانشیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: بیماری‌ها و آسیب‌های استخوانی شامل شکستگی‌های استخوانی در طی تصادفات و تروما در همه‌ی جوامع شیوع فراوانی دارد و در اکثر موارد استخوان خرد شده قادر به ترمیم نیست؛ به علاوه، روش‌های درمانی مورد استفاده نظیر پیوند بافت استخوانی به صورت آلوگرافت و اتوگرافت خطرات و مشکلاتی را به دنبال دارد. یکی از راه‌های درمان، استفاده از سلول‌های استخوانی خود فرد، کشت آن‌ها بر روی داربست مناسب و انتقال به بیمار می‌باشد. در این مطالعه، ضمن کشت سلول‌های استئوبلاست به صورت تک لایه‌ای و داربست هیدروکسی آپاتیت- تری کلسیم فسفات (HA-TC)، ویژگی‌های این سلول‌ها در دو روش کشت متفاوت مورد بررسی قرار گرفت.روش‌ها: در جریان عمل جراحی کرانیوتومی در بیمارستان الزهرای (س) اصفهان از 5 فرد نمونه‌ی استخوانی تهیه و به روش استریل به آزمایشگاه ارسال شد. هر نمونه پس از شستشو با PBS به قطعات کوچک تقسیم و پس ازقرار دادن در پلیت محتوی محیط کشت به انکوباتور منتقل گردید. در روز 12-10 سلول‌ها شروع به خروج از استخوان نموده، پس از پوشاندن کف پلیت با استفاده از آنزیم Trypsin_EDTA ازکف پلیت جدا شد و به دوگروه تقسیم گردید. در گروه اول، سلول‌ها بر داربست HA-TC و در گروه دیگر به صورت تک لایه‌ای کشت داده شدند. رنگ آمیزی Van kossa، شمارش سلولی، روش MTT، رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز و روش فلوسایتومتری جهت بررسی ویژگی‌های سلول‌های استئوبلاستی به کار گرفته شد.یافته‌ها: در کشت سلول‌ها به صورت تک لایه‌ای، سلول‌هایی با مورفولوژی فیبروبلاستی و یا دوکی مشاهده شد. با رنگ آمیزی Van kossa وجود رسوبات مواد معدنی در دو گروه مشخص گردید. میزان تکثیر سلولی در داربست HA-TC نسبت به تک لایه‌ای بیشتر بود (001/0 > P). میزان فعالیت سلول‌های زنده نیز در داربست HA-TC نسبت به تک لایه‌ای افزایش نشان داد (001/0 > P). در رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز وجود گرانول‌های آبی مشاهده شد؛ نتایج فلوسایتومتری نشان داد که 57 درصد سلول‌ها در کشت اولیه و 5 درصد در پاساژ سوم دارای مارکر آلکالین فسفاتاز هستند.نتیجه گیری: با توجه به نتایج تحقیق حاضر می‌توان گفت که داربست هیدروکسی آپاتیت- تری‌کلسیم داربست مناسب تری برای کشت سلول‌های استئوبلاستی نسبت به کشت تک لایه‌ای است. احتمال می‌رود علت این باشد که داربست هیدروکسی آپاتیت- تری‌کلسیم حاوی کلسیم و اجزای مشابه ماتریکس استخوانی است و وجود تخلخل و منافذ مناسب در این داربست موجب تسهیل تغذیه‌ی سلول‌ها نسبت به کشت تک لایه‌ای می‌شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The Characteristics of Human Osteoblast Cells in Two Methods of Monolayer Culture in Hydroxyapatite-Tricalcium Phosphate Scafolds

نویسندگان [English]

  • Batool Hashemibeni 1
  • Fereshteh Ali Akbari 2
  • Farzaneh Sadeghi 3
  • Ebrahim Esfandiary 4
  • Hamid Bahramian 1
  • Hosein Sadeghi 5
1 Assistant Professor, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran.
2 PhD Student, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
3 Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4 Professor, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
5 Assistant Professor, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran.
چکیده [English]

Background: Bone diseases and injuries, including bone fractures during accidents and trauma, in all communities are prevalent and in most cases, crushed bone is not able to repair; various treatment ways including tissue graft from an allograft or autograft have risks and lead to problems. One method for treatment of bone fractures is using outologous osteoblasts with culturing on suitable scaffolds and then implant of cells to defect region. In this study, we cultured osteoblast cells on monolayer and calcium phosphate hydroxyapatite (HA-TC) scaffolds and the behavior of these two types of cells in different cultures were analyzed.Methods: During the craniotomy operation in Alzahra hospital in five individual, bone samples were obtained and in sterile condition were sent to the laboratory. Each sample after washing with PBS was cut into small pieces and plates containing the medium culture were transferred to the incubator. After 10-12 days, the cells have started to leave the bones covering the floor plate and after using the enzyme Trypsin_EDTA isolated from plate divided into two groups. One group was cultured in HA-TC scaffold and other as monolayer culture. Van kossa staining, flow cytometry, alkaline phosphatase assay and MTT method were used to investigate the characteristics of osteoblasts.Finding: Osteoblasts in monolayer culture were observed as fibroblast- like cells. Van kossa staining determined the mineral deposits in the two groups. The cell proliferation increased in cellular scaffolding HA-TC more than monolayer (P < 0.001). Results of MTT showed more activity items on living cells in scaffold HA-TC than monolayer (P < 0.001). In alkaline phosphatase staining, blue granules were observed; in the flow cytometry, 57 percent of primary cultured cells and 5 percent in the third passage cells showed alkaline phosphatase marker.Conclusion: According to the results of this study, the hydroxyapatite scaffold is better than monolayer culture for osteoblast cells. This could be because of having more calcium and similar elements to bone matrix that facilitate feeding cultured cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Monolayer culture
  • Bone regeneration
  • Hydroxyapatite-calcium phosphate
  • Osteoblast

مراجع

  1. Cai X, Lin Y, Ou G, Luo E, Man Y, Yuan Q, et al. Ectopic osteogenesis and chondrogenesis of bone marrow stromal stem cells in alginate system. Cell Biol Int 2007; 31(8): 776-83.
  2. Cancedda R, Dozina B, Giannonia P, Quartob R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biology 2003; 22(1): 81-91.
  3. Ishaug-Riley SL, Crane-Kruger GM, Yaszemski MJ, Mikos AG. Three-dimensional culture of rat calvarial osteoblasts in porous biodegradable polymers. Biomaterials 1998; 19(15): 1405-12.
  4. Aronow MA, Gerstenfeld LC, Owen TA, Tassi-nari MS, Stein GS, Lian JB. Factors that promote progressive development of the osteoblast phenotype in cultured fetal rat calvaria cells. J Cell Physiol 1990; 143(2): 213-21.
  5. Awad HA, Wickham MQ, Leddy HA, Gimble JM, Guilak F. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds. Biomaterials 2004; 25(16): 3211-22.
  6. Wiedmann-Al-Ahmad M, Gutwald R, Lauer G, Hubner U, Schmelzeisen R. How to optimize seeding and culturing of human osteoblast-like cells on various biomaterials. Biomaterials 2002; 23(16): 3319-28.
  7. Hagewald S, Pischon N, Jawor P, Bernimoulin JP, Zimmermann B. Effects of enamel matrix derivative on proliferation and differentiation of primary osteoblasts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004; 98(2): 243-9.
  8. George J, Onodera J, Miyata T. Biodegradable honeycomb collagen scaffold for dermal tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2008; 87(4): 1103-11.
  9. Morris VJ. Gelation of polysaccharides. In: Mitchell JR, Ledward DA, Editors. Functional properties of food macromolecules. New York: Elsevier Applied Science Publishers; 1986. p. 121-8.
  10. Kurashina K, Kurita H, Wu Q, Ohtsuka A, Kobayashi H. Ectopic osteogenesis with biphasic ceramics of hydroxyapatite and tricalcium phosphate in rabbits. Biomaterials 2002; 23(2): 407-12.
  11. Alam MI, Asahina I, Ohmamiuda K, Takahashi K, Yokota S, Enomoto S. Evaluation of ceramics composed of different hydroxyapatite to tricalcium phosphate ratios as carriers for rhBMP-2. Biomaterials 2001; 22(12): 1643-51.
  12. Sun JS, Tsuang YH, Liao CJ, Liu HC, Hang YS, Lin FH. The effects of calcium phosphate particles on the growth of osteoblasts. J Biomed Mater Res 1997; 37(3): 324-34.
  13. Wu W, Chen X, Mao T, Chen F, Feng X. Bone marrow-derived osteoblasts seeded into porous beta-tricalcium phosphate to repair segmental defect in canine's mandibula. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 2006; 12(4): 268-76.
  14. Pang L, Yun H, Yan Yong N, Liu L, Xiong Z, Wei Y. Repair of rabbit segmental defects with the hybrid rp scaffold. J of US_China Medical Science 2007; 4(2): 1548-60.
  15. Li Z, Ramay HR, Hauch KD, Xiao D, Zhang M. Chitosan-alginate hybrid scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2005; 26(18): 3919-28.
  16. Van Griensven M, Zeichen J, Tschernig T, Seekamp A, Pape HC. A modified method to culture human osteoblasts from bone tissue specimens using fibrin glue. Exp Toxicol Pathol 2002; 54(1): 25-9.
  17. Weber M, Steinert A, Jork A, Dimmler A, Thurmer F, Schutze N, et al. Formation of cartilage matrix proteins by BMP-transfected murine mesenchymal stem cells encapsulated in a novel class of alginates. Biomaterials 2002; 23(9): 2003-13.
  18. Turhani D, Weissenbock M, Watzinger E, Yerit K, Cvikl B, Ewers R, et al. Invitro study of adherent mandibular osteoblast-like cells on carrier materials. Int J Oral Maxillofac Surg 2005; 34(5): 543-50.
  19. Yamamoto M, Tabata Y, Kawasaki H, Ikada Y. Promotion of fibrovascular tissue ingrowth into porous sponges by basic fibroblast growth factor. J Mater Sci Mater Med 2000; 11(4): 213-8.
  20. Quong D, Neufeld RJ, Skjak-Braek G, Poncelet D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng 1998; 57(4): 438-46.
  21. Jiang XQ, Wang SY, Zhao J, Zhang XL, Zhang ZY. Sequential fluorescent labeling observation of maxillary sinus augmentation by a tissue-engineered bone complex in canine model. Int J Oral Sci 2009; 1(1): 39-46.
  22. Jalota S, Bhaduri SB, Tas AC. In vitro testing of calcium phosphate (HA, TCP, and biphasic HA-TCP) whiskers. J Biomed Mater Res A 2006; 78(3): 481-90.
  23. Abbah SA, Lu WW, Chan D, Cheung KM, Liu WG, Zhao F, et al. In vitro evaluation of alginate encapsulated adipose-tissue stromal cells for use as injectable bone graft substitute. Biochem Biophys Res Commun 2006; 347(1): 185-91.
  24. Abbah SA, Lu WW, Chan D, Cheung KM, Liu WG, Zhao F, et al. Osteogenic behavior of alginate encapsulated bone marrow stromal cells: an in vitro study. J Mater Sci Mater Med 2008; 19(5): 2113-9.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 28، شماره 119 - شماره پیاپی 119
بهمن و اسفند 1389
صفحه 1348-1358

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 21 بهمن 1389
  • تاریخ بازنگری: 12 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار