کلون، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب هماگلوتینین ویروس آنفلوانزا H1N1 انسانی در رده‌ی یوکاریوتیک سلول حشره با استفاده از وکتور باکولوویروس

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه زیست‌شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

2 استادیار مدعو، گروه زیست‌شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران و استادیار، بخش تحقیق و توسعه، مؤسسه‌ی تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

3 استادیار، گروه زیست‌شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

4 استادیار مدعو، گروه زیست‌شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران و استادیار، مرکز تحقیقات واکسن‌های نوترکیب، دانشکده‌ی داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

5 استادیار مدعو، گروه زیست‌شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران و استادیار، مجتمع تولیدی- تحقیقاتی، انستیتو پاستور ایران، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: ویروس آنفلوانزا H1N1 به عنوان عامل بیماری‌زا و تهدید کننده‌ی حیات انسان مطرح می‌شود. واکسیناسیون، از راه‌های مؤثر برای پیش‌گیری و مهار بیماری آنفلوانزا است. تولید پروتئین نوترکیب هماگلوتینین در سیستم بیانی باکولوویروس، در بستر سلول یوکاریوت حشره (Sf9) به عنوان یک راهکار مؤثر پیشنهاد شده است.روش‌ها: توالی ژن هماگلوتینین ویروس آنفلوانزا H1N1 از National Center for Biotechnology Information (NCBI) استنتاج و پس از طراحی پرایمر اختصاصی، توالی با استفاده از هضم آنزیمی در پلاسمید pFastBacHTA کلون گردید و برای تولید یک بکمید نوترکیب به سلول DH10Bac انتقال داده شد. پس از استخراج پلاسمید مربوط و تأیید صحت کار، به داخل سلول حشره ترانسفکت گردید و بعد از بیان پروتئین توسط سلول Sf9، با روش Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) و Western blot، حضور پروتئین نوترکیب تأیید ‌شد.یافته‌ها: ژن هماگلوتینین با طول 654 جفت‌باز در پلاسمید pFastBacHTA به کمک دو آنزیم BamHI و Xhol ساب کلون گردید. سلول حشره بعد از دریافت بکمید نوترکیب، پروتئینی به وزن تقریبی 60 کیلودالتون را بیان نمود. پس از استخراج پروتئین، با روش‌های SDS-PAGE و Western blot تأیید انجام گرفت و با روش Lowry، غلظت پروتئین اندازه‌گیری شد.نتیجه‌گیری: سیستم بیانی باکولوویروس برای تولید پروتئین‌هایی با ساختار پیچیده مفید است. به طور کلی، از این طرح می‌توان به این نتیجه رسید که این پروتئین در سلول حشره به میزان بالایی بیان می‌شود و به دلیل تشابه سیستم آن با سیستم انسانی، می‌تواند در آینده به عنوان جایگزین مناسب برای تخم‌مرغ‌های جنین‌دار در زمینه‌ی واکسیناسیون مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning, Expression, and Purification of the Recombinant Hemagglutinin of Human Influenza Virus H1N1 in the Eukaryotic Insect Cells Using Baculovirus Vector

نویسندگان [English]

  • Niloufar Rashedi 1
  • Morteza Taghizadeh 2
  • Parisa Mohamadynejad 3
  • Mehdi Mahdavi 4
  • Reza Jalalirad 5
1 PhD Student, Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
2 Invited Assistant Professor, Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran AND Assistant Professor, Department of Research and Development, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
3 Assistant Professor, Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
4 Invited Assistant Professor, Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran AND Assistant Professor, Recombinant Vaccine Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
5 Invited Assistant Professor, Department of Biology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran AND Assistant Professor, Production and Research Complex, Pasteur Institute of Iran, Karaj, Iran
چکیده [English]

Background: The H1N1 influenza virus is a highly pathogenic virus that threatens human life. Vaccination is an effective way of preventing and controlling influenza. Production of recombinant hemagglutinin in the baculovirus expression system, in the insect eukaryotic cell substrate (Sf9), has been suggested as an effective strategy.Methods: The H1N1 influenza virus hemagglutinin gene sequence was prepared from National Center for Biotechnology Information (NCBI). After designing a specific primer, the sequence was provided using restriction digestion, cloned into pFastBacHTA plasmid, and transferred to the DH10Bac cell to produce a recombinant bacmid. After extracting the relevant plasmid, it was transfused into the insect cell; and after the expression of the protein by Sf9 cell, the presence of recombinant protein was confirmed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot methods.Findings: The hemagglutinin gene (654 bp) was cloned in pFastBacHTA plasmid using the two enzymes of BamHI and Xhol. Sf9 cell expressed a protein weighing approximately 60 kDa after receiving the recombinant bacmid protein. The extracted protein was identified and confirmed using SDS-PAGE and Western blot methods; and protein concentration was measured by Lowry method.Conclusion: The baculovirus system is useful for the production of proteins with complex structures. Generally, it can be concluded that this protein is highly expressed in insect cells. Due to the similarity of this system with the human system, it can be a suitable alternative for embryonic eggs in the future, and can be used in vaccination.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Influenza A virus
  • H1N1 subtype
  • Hemagglutinins
  • Sf9 cells
  • Baculovirus

مراجع

  1. Munster VJ, Fouchier RA. Avian influenza virus: of virus and bird ecology. Vaccine 2009; 27(45): 6340-4.
  2. Alexander DJ. A review of avian influenza in different bird species. Vet Microbiol 2000; 74(1-2): 3-13.
  3. Knipe D, Howley P, Cohen J, Griffin D, Lamb R, Martin M, et al. Fields virology. Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins; 2013.
  4. Roos R. WHO says H1N1 pandemic is over. Minneapolis, MN: Center for Infectious Disease Research and Policy Office of the Vice President for Research, University of Minnesota; 2010.
  5. Hussain M, Galvin HD, Haw TY, Nutsford AN, Husain M. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infect Drug Resist 2017; 10: 121-34.
  6. Ligon BL. Avian influenza virus H5N1: A review of its history and information regarding its potential to cause the next pandemic. Semin Pediatr Infect Dis 2005; 16(4): 326-35.
  7. Hitchman RB, Possee RD, King LA. Baculovirus expression systems for recombinant protein production in insect cells. Recent Pat Biotechnol 2009; 3(1): 46-54.
  8. Steel J. New strategies for the development of H5N1 subtype influenza vaccines: progress and challenges. BioDrugs 2011; 25(5): 285-98.
  9. Cox MM. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine 2012; 30(10): 1759-66.
  10. Berger I, Fitzgerald DJ, Richmond TJ. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat Biotechnol 2004; 22(12): 1583-7.
  11. Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Ahmad A, Gavrilov V, et al. Influenza virus-like particles elicit broader immune responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin. Vaccine 2007; 25(19): 3871-8.
  12. Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW. Influenza virus-like particles as pandemic vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 2009; 333: 269-89.
  13. Ludwig C, Wagner R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol 2007; 18(6): 537-45.
  14. Tinsley TW, Harrap KA. Viruses of Invertebrates. In: Fraenkel-Conrat H, editor. Newly Characterized Protist and Invertebrate Viruses. Boston, MA: Springer US; 1978. p. 1-101.
  15. Wang K, Holtz KM, Anderson K, Chubet R, Mahmoud W, Cox MMJ. Expression and purification of an influenza hemagglutinin-one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine. Vaccine 2006; 24(12): 2176-85.
  16. Song L, Nakaar V, Kavita U, Price A, Huleatt J, Tang J, et al. Efficacious recombinant influenza vaccines produced by high yield bacterial expression: a solution to global pandemic and seasonal needs. PLoS One 2008; 3(5): e2257.
  17. Hu YC, Luo YL, Ji WT, Chulu JL, Chang PC, Shieh H, et al. Dual expression of the HA protein of H5N2 avian influenza virus in a baculovirus system. J Virol Methods 2006; 135(1): 43-8.
  18. Powers DC, Kilbourne ED, Johansson BE. Neuraminidase-specific antibody responses to inactivated influenza virus vaccine in young and elderly adults. Clin Diagn Lab Immunol 1996; 3(5): 511-6.
  19. Ahmad B, Li Z, Hanif Q, Hu Q, Wei X, Zhang L, et al. A Hybrid Peptide DEFB-TP5 Expressed in Methylotrophic Yeast Neutralizes LPS with Potent Anti-inflammatory Activities. Front Pharmacol 2020; 11: 461.
  20. Soleimanjahi H, Fotouhi F. Baculoviruses and insect cells as powerful tools for gene expression. Tehran, Iran: Jahad Daneshgahi; 2009. [In Persian].
  21. Luckow VA, Summers MD. Trends in the Development of Baculovirus Expression Vectors. Bio/Technology 1988; 6(1): 47-55.
  22. Kitts PA, Possee RD. A method for producing recombinant baculovirus expression vectors at high frequency. Biotechniques 1993; 14(5): 810-7.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 38، شماره 572 - شماره پیاپی 572
خرداد و تیر 1399
صفحه 260-266

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 30 فروردین 1399
  • تاریخ بازنگری: 12 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار