مطالعه‌ی بیوانفورماتیکی و بررسی بیان ژن بهینه ‌شده‌ی زیر واحد B کلرا توکسین به عنوان کاندید واکسن

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده‌ی علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران

2 دانشجوی دکتری، مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده‌ی علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران

3 پژوهشگر، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: وبا بیماری خطرناکی است که توسط باکتری ویبریوکلرا ایجاد می‌شود. توکسین کلرا مهم‌ترین عامل ویرولانس در بیماری‌زایی ویبریو کلرا می‌باشد. زیر واحد B انتروتوکسین (CtxB یا Cholera toxin subunit B) که مسؤول اتصال سم به سلول یوکاریوتی است، ویژگی‌های ایمونوژنیک دارد. هدف از این تحقیق، بررسی بیوانفورماتیکی و تولید پروتئین نوترکیب (CtxB) بود.روش‌ها: ژن CtxB به لحاظ وجود کدون‌های نادر مورد بررسی قرار گرفت و بهینه‌سازی ژن با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی انجام شد. پلاسمید نوترکیب a/CtxB28pET به سلول‌های 3DE 21BL E.coli (Escherichia coli) منتقل و بیان پروتئین با استفاده از IPTG (thiogalactopyranoside-1-Isopropyl β-D) القا گردید. بیان پروتئین با روش SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate- Polyacrylamide gel electrophoresis) وسترن بلاتینگ ارزیابی شد. پروتئین نوترکیب به روش کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriacetic acid) تخلیص گردید.یافته‌ها: شاخص سازگاری کدون (CAI یا Codon adaptation index) مربوط به ژن طبیعی 61/0 بود؛ در حالی که ژن بهینه‌سازی شده شاخص 92/0 را داشت. درصد کدون‌های با شیوع بالا در ژن به 67 درصد بهبود یافت. آنالیز آنزیمی صحت همسانه‌سازی ژن CtxB در وکتور a/CtxB28pET را تأیید کرد. وسترن بلاتینگ واکنش اختصاصی پروتئین نوترکیب با آنتی بادی ضد توکسین کلرا را نشان داد. میزان پروتئین خالص شده برای هر لیتر از محیط، 9 میلی‌گرم بود.نتیجه‌گیری: بهینه‌سازی ژن CtxB روش مناسب برای بیان بالای پروتئین نوترکیب می‌باشد. این پروتئین را می‌توان به صورت کپسوله شده به منظور ایمنی‌زایی خوراکی تولید کرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Bioinformatical Study and Evaluation of Expression of Cholera Toxin Subunit B Optimized Gene as a Vaccine Candidate

نویسندگان [English]

  • Shahram Nazarian 1
  • Mohhamad Ali Arefpour 2
  • Mohhamd Javad Bagheripour 2
  • Golamreza Olad 3
1 Biology Research Centre, School of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran
2 Biology Research Centre, School of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran
3 Applied Biotechnology Research Centre, Baqitatolah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Cholera is a lethal diarrheal disease caused by Vibrio cholerae. Cholera toxin is the major virulence factor in pathogenesis of Vibrio cholerae. The B subunit of the enterotoxin, which is responsible for toxin binding to eukaryotic cells, has immunogenic properties. The aim of this study was bioinformatic investigation and production of recombinant cholera toxin subunit B (CtxB).Methods: CtxB gene was analysed for rare codons and gene optimization was performed using optimization software. Recombinant pET28a/ctxb plasmid was transformed to E. coli BL21 DE3 and expression was induced with Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The protein expression was evaluated using Sodium dodecyl sulphate- Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blotting analysis. The recombinant protein was purified using Nickel-Nitrilotriacetic acid (Ni–NTA) affinity chromatography.Findings: Codon adaptation index (CAI) on the native gene was 0.61, while the optimized sequence had a CAI of 0.92. Percentage of codon having high-frequency distribution was improved to 67%. Restriction analysis confirmed cloning of the CtxB gene into pET28a vector. Western blotting showed specific reactivity of recombinant protein with anti-CTX antibody. The total yield of purified protein was 9 mg/l.Conclusion: The results indicated that CtxB gene optimization is a useful approach to high-level expression of recombinant protein. The protein could be produced in capsulated form for oral immunization purpose.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cholera toxin
  • Cholera enterotoxin subunit B (CtxB)
  • Gene optimization
  • Recombinant protein

مراجع

  1. Mousavi SL, Nazarian S, Amani J, Rahgerdi AK. Rapid screening of toxigenic vibrio cholerae O1 strains from south Iran by PCR-ELISA. Iran Biomed J 2008; 12(1): 15-21.
  2. Mandal S, Mandal MD, Pal NK. Cholera: a great global concern. Asian Pac J Trop Med 2011; 4(7): 573-80.
  3. Vanden Broeck D, Horvath C, De Wolf MJ. Vibrio cholerae: cholera toxin. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39(10): 1771-5.
  4. Hill DR, Ford L, Lalloo DG. Oral cholera vaccines: use in clinical practice. Lancet Infect Dis 2006; 6(6): 361-73.
  5. Mousavi SL, Rasouli I, Nazarian SH, Amani J. Simultaneous detection of escherichia coli o157:h7, toxigenic vibrio cholerae, and salmonella typhimurium by multiplex pcr. Iran J Clin Infect Dis 2009; 4(2): 97-103. [In Persian].
  6. Bharati K, Ganguly NK. Cholera toxin: a paradigm of a multifunctional protein. Indian J Med Res 2011; 133: 179-87.
  7. Banerjee R, Das B, Balakrish NG, Basak S. Dynamics in genome evolution of Vibrio cholerae. Infect Genet Evol 2014; 23: 32-41.
  8. Sanchez J, Holmgren J. Cholera toxin structure, gene regulation and pathophysiological and immunological aspects. Cell Mol Life Sci 2008; 65(9): 1347-60.
  9. Ahmadi S, Mousavi ML, Sorouri R, Salimian J, Karimi A, Nazarian SH, et al. Rapid detection of toxigenic vibrio cholera o1 using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay (PCR-ELISA). Kowsar Medical Journal 2006; 11(1): 41-50. [In Persian].
  10. De Haan L, Hirst TR. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms (Review). Mol Membr Biol 2004; 21(2): 77-92.
  11. Fan JL, Peterson JW, Prabhakar BS. Adjuvant effects of cholera toxin b subunit on immune response to recombinant thyrotropin receptor in mice. J Autoimmun 2000; 14(1): 43-52.
  12. Sun JB, Eriksson K, Li BL, Lindblad M, Azem J, Holmgren J. Vaccination with dendritic cells pulsed in vitro with tumor antigen conjugated to cholera toxin efficiently induces specific tumoricidal CD8+ cytotoxic lymphocytes dependent on cyclic AMP activation of dendritic cells. Clin Immunol 2004; 112(1): 35-44.
  13. Tochikubo K, Isaka M, Yasuda Y, Kozuka S, Matano K, Miura Y, et al. Recombinant cholera toxin B subunit acts as an adjuvant for the mucosal and systemic responses of mice to mucosally co-administered bovine serum albumin. Vaccine 1998; 16(2-3): 150-5.
  14. Kim HJ, Kim JK, Seo SB, Lee HJ, Kim HJ. Intranasal vaccination with peptides and cholera toxin subunit B as adjuvant to enhance mucosal and systemic immunity to respiratory syncytial virus. Arch Pharm Res 2007; 30(3): 366-71.
  15. de Geus B, Dol-Bosman M, Scholten JW, Stok W, Bianchi A. A comparison of natural and recombinant cholera toxin B subunit as stimulatory factors in intranasal immunization. Vaccine 1997; 15(10): 1110-3.
  16. Puigbo P, Guzman E, Romeu A, Garcia-Vallve S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res 2007; 35(Web Server issue): W126-W131.
  17. Nazarian S, Mousavi Gargari SL, Rasooli I, Amani J, Bagheri S, Alerasool M. An in silico chimeric multi subunit vaccine targeting virulence factors of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) with its bacterial inbuilt adjuvant. J Microbiol Methods 2012; 90(1): 36-45.
  18. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res 2003; 31(13): 3406-15.
  19. Nazarian S, Gargari SL, Rasooli I, Hasannia S, Pirooznia N. A PLGA-encapsulated chimeric protein protects against adherence and toxicity of enterotoxigenic Escherichia coli. Microbiol Res 2014; 169(2-3): 205-12.
  20. Isaka M, Yasuda Y, Kozuka S, Taniguchi T, Matano K, Maeyama J, et al. Induction of systemic and mucosal antibody responses in mice immunized intranasally with aluminium-non-adsorbed diphtheria toxoid together with recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant. Vaccine 1999; 18(7-8): 743-51.
  21. Kundu J, Mazumder R, Srivastava R, Srivastava BS. Intranasal immunization with recombinant toxin-coregulated pilus and cholera toxin B subunit protects rabbits against Vibrio cholerae O1 challenge. FEMS Immunol Med Microbiol 2009; 56(2): 179-84.
  22. Zeighami H, Sattari M, Rezayat M. Purification of the recombinant beta subunit of Vibrio cholera entrotoxin. J Arak Univ Med Sci 2011; 14(3): 27-35. [In Persian].
  23. Lebens M, Shahabi V, Backstrom M, Houze T, Lindblad N, Holmgren J. Synthesis of hybrid molecules between heat-labile enterotoxin and cholera toxin B subunits: potential for use in a broad-spectrum vaccine. Infect Immun 1996; 64(6): 2144-50.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 279 - شماره پیاپی 279
فروردین و اردیبهشت 1393
صفحه 378-387

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 21 بهمن 1392
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار