بهینه‌سازی بیان پروتئین اینترلوکین-5 در باکتری Escherichia Coli سویه‌ی BL21

جمالوندی, مینا; خان‌احمد, حسین; ایرانی, شیوا; بسطامی‌نژاد, صیاد

doi:10.22122/jims.v38i592.13008

بهینه‌سازی بیان پروتئین اینترلوکین-5 در باکتری Escherichia Coli سویه‌ی BL21

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

¹ دکتری ژنتیک، گروه زیست ‌شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

² دانشیار، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی،، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

³ دانشیار، گروه زیست ‌شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

⁴ دانشیار، گروه ژنتیک، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایلام، ایلام، ایران

10.22122/jims.v38i592.13008

چکیده

مقدمه: در آسم، رابطه‌ی بین تعداد ائوزینوفیل‌ها و شدت بیماری، این فرضیه را تقویت می‌کند که ائوزینوفیل، سلول مؤثر اصلی در التهاب راه‌های هوایی است. تکامل ائوزینوفیل به طور عمده با اینترلوکین-5 تنظیم می‌شود. بنابراین، با ممانعت از عملکرد اینترلوکین- 5 (IL-5)، می‌توان حداقل یکی از دلایل ایجاد آسم را سرکوب کرد. برای تولید آنتاگونیست‌هایی مثل آپتامر ضد اینترلوکین-5، لازم است این پروتئین به مقدار زیاد و با خلوص بالا بیان گردد. مطالعه‌ی حاضر با هدف تهیه‌ی اپتامر ضد IL-5 به جای آنتی‌بادی جهت استفاده در درمان بیماری‌های ائوزینوفیلیک و بیان این پروتئین در یک سیستم پروکاریوتی انجام شد.روش‌ها: ابتدا سازه‌ی حاوی complementary DNA (cDNA) ژن پروتئین اینترلوکین-5 طراحی و سفارش ساخت در وکتور pET28a داده شد. وکتور بیانی به باکتری‌های مستعد شده‌ی Escherichia coli BL21 (DE3) تبدیل شد. سپس، بیان پروتئین با تغییر شرایط دما و زمان انکوباسیون و میزان Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) بهینه گردید. ارزیابی بیان پروتئین با به کار گیری روش‌های Western blot و Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) و در مراحل مختلف صورت گرفت.یافته‌ها: شرایط بهینه برای بیان پروتئین اینترلوکین-5، غلظتی از باکتری که در طول موج 600 نانومتر جذب بین 8/0-6/0 داشت، غلظت نهایی 1 میلی‌مولار برای IPTG، 18 ساعت انکوباسیون در دمای 29 درجه‌ی سانتی‌گراد و شتاب 150 دور/دقیقه بود. باند 13 کیلودالتونی روی ژل پلی‌آکریل‌آمید در SDS-PAGE و غشای نیتروسلولزی در روش Western blot تأیید کننده‌ی بیان پروتئین اینترلوکین-5 بود.نتیجه‌گیری: از این پروتئین، در فرایندهایی چون تهیه‌ی آپتامر بر علیه IL-5 و کیت‌های Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)ی مخصوص اندازه‌گیری IL-5 می‌توان استفاده نمود. در این فرایندها، به آنتی‌ژن با فولدینگ بسیار صحیح نیاز نمی‌باشد. بنابراین، بیان در سیستم پروکایوتی به علت بازده بالا انجام شد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Optimization of Interleukin-5 Protein Expression in BL21 Strain of Escherichia Coli

نویسندگان [English]

mina Jamalvandi ¹
Hossein Khanahmad ²
Shiva Irani ³
Sayad Bastaminejad ⁴

¹ PhD in Genetics, Department of Biology, School of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

² Associate Professor, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

³ Associate Professor, Department of Biology, School of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

⁴ Associate Professor, Department of Genetics, School of Medicine, Ilam University of Medical Sciences, Ilam, Iran

چکیده [English]

Background: In asthma, the relationship between number of eosinophils and severity of this disease supports the hypothesis that eosinophil is the major effector cell in inflammation of airway. Evolution of eosinophils is regulated by interlukin-5 (IL-5). Therefore, by blocking IL-5, at least one major reason of asthma would be prevented. To produce antagonists against IL-5 (like aptamer), it is necessary to have this protein in large scale and high purity. This study aimed to optimize IL-5 protein expression of BL21 strain of Escherichia coli (E. coli) to be used instead of antibody.Methods: At first, complementary DNA (cDNA) construct encoding IL-5 was designed, and was ordered to be produced in pET28a vector. Expression vector was transformed into competent E. coli Bl21 (DE3) origami. Then, protein expression was optimized by altering temperature, incubation time, and the amount of isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Protein expression was assessed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot in different levels of the test.Findings: The optimum conditions for protein expression were gained when the density of bacteria at the OD600 reached to 0.6 to 0.8, and culturing was done at 29 °C for 18 hours and 150 rpm, andinduction with 1mM IPTG. There was a 13-kDa protein band on SDS-PAGE and western blot that confirmed the expression of IL-5 protein.Conclusion: This protein can be used for producing aptamers against IL-5 and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for measuring IL-5. In all these process, there is no need to perfect folding of the protein. Therefore, the expression can be done in prokaryotic system, as it has high efficiency.

کلیدواژه‌ها [English]

Gene Expression
Interleukin-5
Prokaryotic cells
Escherichia coli

مراجع

Haldar P, Brightling CE, Hargadon B, Gupta S, Monteiro W, Sousa A, et al. Mepolizumab and exacerbations of refractory eosinophilic asthma. N Engl J Med 2009; 360(10): 973-84.
Greenfeder S, Umland SP, Cuss FM, Chapman RW, Egan RW. Th2 cytokines and asthma. The role of interleukin-5 in allergic eosinophilic disease. Respir Res 2001; 2(2): 71-9.
Miranda C, Busacker A, Balzar S, Trudeau J, Wenzel SE. Distinguishing severe asthma phenotypes: role of age at onset and eosinophilic inflammation. J Allergy Clin Immunol 2004; 113(1): 101-8.
Flood-Page PT, Menzies-Gow AN, Kay AB, Robinson DS. Eosinophil's role remains uncertain as anti-interleukin-5 only partially depletes numbers in asthmatic airway. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167(2): 199-204.
Rothenberg ME, Klion AD, Roufosse FE, Kahn JE, Weller PF, Simon HU, et al. Treatment of patients with the hypereosinophilic syndrome with mepolizumab. N Engl J Med 2008; 358(12): 1215-28.
Menzella F, Lusuardi M, Galeone C, Taddei S, Facciolongo N, Zucchi L. Mepolizumab for severe refractory eosinophilic asthma: evidence to date and clinical potential. Ther Adv Chronic Dis 2016; 7(6): 260-77.
Song KM, Lee S, Ban C. Aptamers and their biological applications. Sensors (Basel) 2012; 12(1): 612-31.
Ruigrok VJ, Levisson M, Hekelaar J, Smidt H, Dijkstra BW, van der Oost J. Characterization of aptamer-protein complexes by X-ray crystallography and alternative approaches. Int J Mol Sci 2012; 13(8): 10537-52.
Sambrook J, Russell DW. Gel retardation assays for dna-binding proteins. Cold Spring Harb Protoc 2006; 2006(1): prot3948.
Sadeghian-Rizi T, Ebrahimi A, Moazzen F, Yousefian H, Jahanian-Najafabadi A. Improvement of solubility and yield of recombinant protein expression in E. coli using a two-step system. Res Pharm Sci 2019; 14(5): 400-7.
Baeshen MN, Al-Hejin AM, Bora RS, Ahmed MM, Ramadan HA, Saini KS, et al. Production of biopharmaceuticals in E. coli: Current scenario and future perspectives. J Microbiol Biotechnol 2015; 25(7): 953-62.
Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 1988; 16(13): 6127-45.
Sheykhi S, Amininasab M, Saffari B, Abdi S. DNA Cloning and expression of alpha-Synuclein Protein in E. coli. Modares Journal of Biotechnology 2018; 9(1): 145-52. [In Persian].
Boshtam M, Khanahmad SH, Feizollahzadeh S, Rahimmanesh I, Asgary S. Expression and purification of biologically active recombinant rabbit monocyte chemoattractant protein1 in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 2018; 365(9): fny070.
Crowl R, Seamans C, Lomedico P, McAndrew S. Versatile expression vectors for high-level synthesis of cloned gene products in Escherichia coli. Gene 1985; 38(1-3): 31-8.
Zarei Jaliani H, Farajnia S, Safdari Y, Mohammadi SA, Barzegar A, Talebi S. Optimized condition for enhanced soluble-expression of recombinant mutant anabaena variabilis phenylalanine ammonia lyase. Adv Pharm Bull 2014; 4(3): 261-6.
Hu Y, An Y, Fang N, Li Y, Jin H, Nazarali A, et al. The Optimization of Soluble PTEN Expression in Escherichia coli. Open Biochem J 2015; 9: 42-8.
Malik A, Alsenaidy AM, Elrobh M, Khan W, Alanazi MS, Bazzi MD. Optimization of expression and purification of HSPA6 protein from Camelus dromedarius in E. coli. Saudi J Biol Sci 2016; 23(3): 410-9.
Lee SE, Kwon SH, Huh JW. Soluble expression and purification of human monocyte chemoattractant protein-1 in escherichia coli via fusion with a small ubiquitin-like modifier. Int J Recent Sci 2015; 6(7): 4999-5003.
Hutchison CA, III, Chuang RY, Noskov VN, Assad-Garcia N, Deerinck TJ, Ellisman MH, et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science 2016; 351(6280): aad6253.