نوع مقاله : مقاله های پژوهشی
نویسندگان
1
دانشجوی داروسازی، دانشکدهی داروسازی و علوم دارویی و کمیتهی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
2
دانشیار، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکدهی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
3
کارشناس ارشد، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکدهی کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان، اصفهان، ایران
4
استادیار، گروه بیوشیمی بالینی و مرکز تحقیقات بیوانفورماتیک، دانشکدهی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
مقدمه: DNA پلیمرازها آنزیمهایی هستند که سنتز مولکول DNA را از دئوکسی ریبونوکئوتیدها بر عهده دارند. این آنزیمها ابزارهای ضروری در زیست شناسی مولکولی به حساب میآیند. DNA پلیمراز Pfu از یک آرکئوباکتری گرمادوست که در رسوبات دریایی با دمای 100-90 درجهی سلسیوس زندگی میکند، جدا گردیده است. این آنزیم، خصوصیت اگزونوکلئازی ۳ به ۵ را دارد که باعث اصلاح خطاهای ناشی از همانندسازی DNA میشود.روشها: در این مطالعه، قطعهی کد کنندهی ژن DNA پلیمراز Pfu در ناقل بیانی b15-pET کلون گردید. سپس با تغییر شرایط بیان مانند غلظت IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)، زمان و دمای القا، بیان این آنزیم بهینه شد. در نهایت در شرایط بهینه، پروتئین در مقیاس بالا تهیه و به روشی ساده تخلیص گردید. سپس آنزیم تخلیص شده، جهت بررسی فعالیت در واکنش PCR (Polymerase chain reaction) به کارگرفته شد.یافتهها: کلونیهایی بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب ایجاد شد که اکثر آنها حاوی پلاسمید بودند. بیان آنزیم Pfu باندی را در حدود KD ۹۰ در ژل الکتروفورز SDS-PAGE (Sodium do decyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis) نتیجه داد. بیشترین میزان تولید پروتئین با غلظت ۷۵/۰ میلیمولار مادهی القا کنندهی IPTG، دمای ۳۷ درجهی سلسیوس و ۳ ساعت پس از القا مشاهده شد.نتیجهگیری: تخلیص پروتئین با به کارگیری روشی جدید بر مبنای پروتکل Desai منجر به ایجاد محصولی شد که در واکنش PCR فعالیتی مشابه با نمونهی تجاری داشت.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Expression and Purification of Pfu DNA Polymerase Belonging to the B Family Polymerase
نویسندگان [English]
-
Mohammad-Reza Mofid
4
-
Daryoush Abedi
2
-
Mahdi Abbasian
3
1
PharmD Student, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2
Associate Professor, Department of Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3
Department of Agricultural Biotechnology, School of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran
4
Assistant Professor, Department of Biochemistry AND Bioinformatics Research Center, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Background: DNA polymerases are enzymes directing the synthesis of DNA molecules from deoxyribonucleotides. They are essential tools for molecular biology. Pfu DNA polymerase was initially isolated from Pyrococcus furiosus, anaerobic hyperthermophilic archaeon lived in geothermally heated marine sediments with temperatures between 90°C and 100°C. This enzyme possesses 3´ to 5´ exonucleotic activity; so that makes correcting the errors made in DNA replication.Methods: In this research, the DNA fragment encoding Pfu DNA polymerase was cloned in to pET-15b expression vector. Then, by changing expression conditions such as isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) concentration, and time and temperature of the induction, the expression of this enzyme was optimized. Finally, Pfu DNA polymerase was produced in large scale in optimized conditions and purified with simple method. Then, purified enzyme was used in polymerase chain reaction (PCR) for evaluating the activity.Findings: Transformation of recombinant vector produced some colonies that most of them have the plasmid. The expression of Pfu DNA polymerase resulted in a bond approximately 90 kDa in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Maximum amount of protein production was observed in IPTG concentration of 0.75 mM, at 37°C, 3 hours incubation.Conclusion: Protein purification with using the method based on Desai protocol caused a product that had the activity like commercial one in PCR reaction.
کلیدواژهها [English]
-
DNA-dependent DNA polymerase
-
Polymerase chain reaction (PCR)
-
Cloning
-
pET-15b