ارزیابی توانایی پروتئین نوترکیب 31Omp بروسلا ملی تنسیس در تکثیر سلول‌های طحال موش‌های ایمن شده در شرایط آزمایشگاه

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار، گروه میکروب‌شناسی و ایمنی شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کاشان، کاشان، ایران

2 استاد، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

3 دانشیار، پژوهشکده‌ی نانوبیوتکنولوژی، پژوهشگاه فناوری‌های نوین ابن سینا، جهاد دانشگاهی و مرکز تحقیقات ایمونولوژی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

4 استاد، پژوهشکده‌ی آنتی‌بادی مونوکلونال، پژوهشگاه فناوری‌های نوین ابن سینا، جهاد دانشگاهی تهران، تهران، ایران

5 دانشیار، مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله (عج)، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: بروسلا یک عامل بیماری‌زا و تهدید کننده‌ی سلامتی برای انسان و احشام در کشورهای در حال توسعه است. سویه‌های تخفیف حدت یافته‌ی بروسلا، امروزه به عنوان واکسن‌هایی برای جلوگیری و کنترل بروسلوز در حیوانات به کار می‌رود. اما به دلیل مشکلات حاصل از این واکسن‌ها، شناسایی کاندیداهای جدید به منظور توسعه‌ی واکسنی زیر واحد مورد نظر است. ایمنی سلولی، ایمنی غالب در حفاظت حیوان علیه بروسلوزیس است. از این رو، کاندیداهای مد نظر باید بتوانند سیستم ایمنی سلولی را تحریک و در آن نسبت به خود خاطره ایجاد کنند. یکی از روش‌هایی که به منظور بررسی قدرت ایجاد خاطره در سلول‌های T به وسیله‌ی آنتی‌ژن استفاده می‌شود، آزمایش بررسی تکثیر می‌باشد. در این مطالعه، تکثیر سلول‌های طحالی موش‌های ایمن شده با پروتئین 31Omp بروسلا ملی تنسیس با استفاده از دو روش ارزیابی تکثیر بر مبنای استفاده از Carboxanil ide-5-tetrazolium-(H2)-(sulphenyl-5-nitro-4-methoxy-2)-bis-(3,2) (XTT) و Diphenyltetrazolium Bromide -5,2-(yl-2-Dimethylthiazol-5,4)-3 (MTT) بررسی شد.روش‌ها: موش‌های BalB/c با استفاده از PBS (Phosphate buffered saline)، 31Omp نوترکیب و واکسن بروسلا ملی تنسیس 1.Rev کشته شده ایمن شدند. 30 روز پس از آخرین تزریق، موش‌ها کشته شدند و طحال آن‌ها جدا گردید. سلول‌های تک هسته‌ای طحال به دست آمده در مجاورت 31Omp (µg/ml 5/2 و 5) نوترکیب قرار گرفتند. میزان تکثیر با اضافه کردن محلول‌های XTT یا MTT اندازه‌گیری و تغییر رنگ حاصل شد.یافته‌ها: لنفوسیت‌های طحال موش‌هایی که با پروتئین نوترکیب 31Omp ایمن شده بودند، بعد از مواجهه‌ی مجدد با این آنتی‌ژن، شروع به تکثیر کردند و این تکثیر، تفاوت معنی‌داری با تکثیر طحال موش‌های ایمن شده با PBS نشان می‌داد (010/0 > P). علاوه بر این، طحال موش‌های ایمن شده با 1.Rev در مقایسه با گروه PBS تکثیر بیشتری نشان داد (010/0 > P). همچنین سهولت استفاده از آزمایش ارزیابی تکثیر با استفاده از XTT نیز نشان داده شد.نتیجه‌گیری: پروتئین 31Omp توانایی تحریک ایمنی سلولی را دارد. علاوه بر این، آزمایش ارزیابی تکثیر با استفاده از رنگ XTT، آزمایشی راحت و ساده به منظور ارزیابی تکثیر سلول‌های طحال می‌باشد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

In-Vitro Potential of Recombinant Omp31 Protein from Brucella Melitensis in Inducing the Proliferation of Immunized Mouse Lymphocytes

نویسندگان [English]

  • Amir Ghasemi 1
  • Mohammad Hossein Salari 2
  • Amir Hassan Zarnani 3
  • Mahmood Jeddi-Tehrani 4
  • Reza Ranjbar 5
1 Assistant Professor, Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
2 Professor, Department of Microbiology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 Associate Professor, Nanobiotechnology Research Center, Avecina Research Institute AND Immunology Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4 Professor, Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute, The Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Tehran, Iran
5 Associate Professor, Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Brucella melitensis infection is still a major health problem for human and cattle in developing countries and the Middle East. Cell-mediated immunity is the dominant immune response required for protection against brucellosis. So, identifying of new candidates which can induce cell-mediated immunity is demanded. Proliferation assay is one of the methods used to evaluate the potential of an antigen to generate memory T-cell. In the present study, the proliferation of speloncyets obtained from immunized mice was evaluated when they were challenged by recombinant Omp31 (rOmp31) in vitro.Methods: Mice were immunized by phosphate buffered saline (PBS), rOmp31 and formalin-killed Brucella melitensis Rev.1 with Freund’s adjuvant. At the day 30, after the last immunization, spleens were removed and homogenized. Purified rOmp31 (2.5 and 5 µg/ml) was added to 2 × 105 spleen cells and then, the speloncytes were incubated at 37◦C in 5% CO2 atmosphere. After 48 hours, XTT [2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assays were used to show the splenocyte proliferation.Findings: The splenocytes of mice immunized with rOmp31or Rev.1 started to proliferate after stimulation with rOmp31. There was a significant difference between SIs obtained from rOmp31 and Rev compared to phosphate buffered saline group (P < 0.01 and P < 0.05, respectively).Conclusion: Based on our findings, rOmp31 could generate a good memory cellular immune response. In addition, the method described here to study the speloncyte proliferation using XTT, is a simple and efficient method.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Brucella
  • Vaccine
  • Recombinant protein
  • Splenocyte
  • Proliferation assay

مراجع

  1. Rajashekara G, Glasner JD, Glover DA, Splitter GA. Comparative whole-genome hybridization reveals genomic islands in Brucella species. J Bacteriol 2004; 186(15): 5040-51.
  2. Ghasemi A, Ranjbar R, Amani J. In silico analysis of chimeric TF, Omp31 and BP26 fragments of Brucella melitensis for development of a multi subunit vaccine candidate. Iran J Basic Med Sci 2014; 17(3): 172-80.
  3. Moriyon I, Grillo MJ, Monreal D, Gonzalez D, Marin C, Lopez-Goni I, et al. Rough vaccines in animal brucellosis: structural and genetic basis and present status. Vet Res 2004; 35(1): 1-38.
  4. Jimenez de Bagues MP, Marin CM, Blasco JM, Moriyon I, Gamazo C. An ELISA with Brucella lipopolysaccharide antigen for the diagnosis of B. melitensis infection in sheep and for the evaluation of serological responses following subcutaneous or conjunctival B. melitensis strain Rev 1 vaccination. Vet Microbiol 1992; 30(2-3): 233-41.
  5. Baldi PC, Giambartolomei GH, Goldbaum FA, Abdon LF, Velikovsky CA, Kittelberger R, et al. Humoral immune response against lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella abortus in cattle vaccinated with B. abortus S19 or experimentally infected with Yersinia enterocolitica serotype 0:9. Clin Diagn Lab Immunol 1996; 3(4): 472-6.
  6. Blasco JM, Diaz R. Brucella melitensis Rev-1 vaccine as a cause of human brucellosis. Lancet 1993; 342(8874): 805.
  7. Pichler WJ, Tilch J. The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity. Allergy 2004; 59(8): 809-20.
  8. Froebel KS, Pakker NG, Aiuti F, Bofill M, Choremi-Papadopoulou H, Economidou J, et al. Standardisation and quality assurance of lymphocyte proliferation assays for use in the assessment of immune function. European Concerted Action on Immunological and Virological Markers of HIV Disease Progression. J Immunol Methods 1999; 227(1-2): 85-97.
  9. Yu HG, Chung H, Yu YS, Seo JM, Heo JW. A new rapid and non-radioactive assay for monitoring and determining the proliferation of retinal pigment epithelial cells. Korean J Ophthalmol 2003; 17(1): 29-34.
  10. Kuhn DM, Balkis M, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol 2003; 41(1): 506-8.
  11. Sadeghifard N, Aslani MM, Ghasemi A. Comparison of different laboratory methods for diagnosis of helicobacter pylori. Journal of Biological Sciences 2006; 6(6): 1146-9.
  12. Estein SM, Cassataro J, Vizcaino N, Zygmunt MS, Cloeckaert A, Bowden RA. The recombinant Omp31 from Brucella melitensis alone or associated with rough lipopolysaccharide induces protection against Brucella ovis infection in BALB/c mice. Microbes Infect 2003; 5(2): 85-93.
  13. Jacques I, Cloeckaert A, Limet JN, Dubray G. Protection conferred on mice by combinations of monoclonal antibodies directed against outer-membrane proteins or smooth lipopolysaccharide of Brucella. J Med Microbiol 1992; 37(2): 100-3.
  14. Cloeckaert A, Jacques I, Bosseray N, Limet JN, Bowden R, Dubray G, et al. Protection conferred on mice by monoclonal antibodies directed against outer-membrane-protein antigens of Brucella. J Med Microbiol 1991; 34(3): 175-80.
  15. Ghasemi A, Salari MH, Zarnani AH, Pourmand MR, Ahmadi H, Mirshafiey A, et al. Immune reactivity of Brucella melitensis-vaccinated rabbit serum with recombinant Omp31 and DnaK proteins. Iran J Microbiol 2013; 5(1): 19-23.
  16. Delpino MV, Estein SM, Fossati CA, Baldi PC, Cassataro J. Vaccination with Brucella recombinant DnaK and SurA proteins induces protection against Brucella abortus infection in BALB/c mice. Vaccine 2007; 25(37-38): 6721-9.
  17. Ghasemi A, Salari MH, Pourmand MR, Zarnani AH, Ahmadi H, Shirazi MH, et al. Optimization and Efficient Purification in Production of Brucella melitensis Recombinant HSP and TF Proteins With Low Endotoxin Contents. Jundishapur J Microbiol 2013; 6(7 SP e6875).
  18. Cassataro J, Pasquevich KA, Estein SM, Laplagne DA, Velikovsky CA, de la Barrera S, et al. A recombinant subunit vaccine based on the insertion of 27 amino acids from Omp31 to the N-terminus of BLS induced a similar degree of protection against B. ovis than Rev.1 vaccination. Vaccine 2007; 25(22): 4437-46.
  19. Foligne B, Nutten S, Grangette C, Dennin V, Goudercourt D, Poiret S, et al. Correlation between in vitro and in vivo immunomodulatory properties of lactic acid bacteria. World J Gastroenterol 2007; 13(2): 236-43.
  20. Horwood NJ, Kartsogiannis V, Quinn JM, Romas E, Martin TJ, Gillespie MT. Activated T lymphocytes support osteoclast formation in vitro. Biochem Biophys Res Commun 1999; 265(1): 144-50.
  21. Hojjat-Farsangi M, Ghaemimanesh F, Daneshmanesh AH, Bayat AA, Mahmoudian J, Jeddi-Tehrani M, et al. Inhibition of the receptor tyrosine kinase ROR1 by anti-ROR1 monoclonal antibodies and siRNA induced apoptosis of melanoma cells. PLoS One 2013; 8(4): e61167.
  22. Slavotinek A, McMillan TJ, Steel CM. Measurement of radiation survival using the MTT assay. Eur J Cancer 1994; 30A(9): 1376-82.
  23. Ghasemi A, Salari MH, Zarnani AH, Pourmand MR, Ahmadi H, Shirazi MH, et al. Immunogenicity assessment of Brucella mellitensis HSP and TF proteins by immunized rabbit serum. Iran J Allergy Asthma Immunol 2013; 12(2): 192-4.
  24. Yang Y, Yin J, Guo D, Lang X, Wang X. Immunization of mice with recombinant S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase protein confers protection against Brucella melitensis infection. FEMS Immunol Med Microbiol 2011; 61(2): 159-67.
  25. Commander NJ, Spencer SA, Wren BW, MacMillan AP. The identification of two protective DNA vaccines from a panel of five plasmid constructs encoding Brucella melitensis 16M genes. Vaccine 2007; 25(1): 43-54.
  26. Luo D, Ni B, Li P, Shi W, Zhang S, Han Y, et al. Protective immunity elicited by a divalent DNA vaccine encoding both the L7/L12 and Omp16 genes of Brucella abortus in BALB/c mice. Infect Immun 2006; 74(5): 2734-41.
  27. Yang X, Hudson M, Walters N, Bargatze RF, Pascual DW. Selection of protective epitopes for Brucella melitensis by DNA vaccination. Infect Immun 2005; 73(11): 7297-303.
  28. Araya LN, Winter AJ. Comparative protection of mice against virulent and attenuated strains of Brucella abortus by passive transfer of immune T cells or serum. Infect Immun 1990; 58(1): 254-6.
  29. Velikovsky CA, Goldbaum FA, Cassataro J, Estein S, Bowden RA, Bruno L, et al. Brucella lumazine synthase elicits a mixed Th1-Th2 immune response and reduces infection in mice challenged with Brucella abortus 544 independently of the adjuvant formulation used. Infect Immun 2003; 71(10): 5750-5.
  30. Al-Mariri A, Tibor A, Mertens P, De B, X, Michel P, Godefroid J, et al. Protection of BALB/c mice against Brucella abortus 544 challenge by vaccination with bacterioferritin or P39 recombinant proteins with CpG oligodeoxynucleotides as adjuvant. Infect Immun 2001; 69(8): 4816-22.
  31. Cespedes S, Andrews E, Folch H, Onate A. Identification and partial characterisation of a new protective antigen of Brucella abortus. J Med Microbiol 2000; 49(2): 165-70.
  32. Tabatabai LB, Pugh GW, Jr. Modulation of immune responses in Balb/c mice vaccinated with Brucella abortus Cu-Zn superoxide dismutase synthetic peptide vaccine. Vaccine 1994; 12(10): 919-24.
  33. Oliveira SC, Splitter GA. Immunization of mice with recombinant L7/L12 ribosomal protein confers protection against Brucella abortus infection. Vaccine 1996; 14(10): 959-62.
  34. Hoover DL, Crawford RM, Van De Verg LL, Izadjoo MJ, Bhattacharjee AK, Paranavitana CM, et al. Protection of mice against brucellosis by vaccination with Brucella melitensis WR201(16MDeltapurEK). Infect Immun 1999; 67(11): 5877-84.
  35. Letesson JJ, Tibor A, van Eynde G, Wansard V, Weynants V, Denoel P, et al. Humoral immune responses of Brucella-infected cattle, sheep, and goats to eight purified recombinant Brucella proteins in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol 1997; 4(5): 556-64.
  36. Cassataro J, Pasquevich K, Bruno L, Wallach JC, Fossati CA, Baldi PC. Antibody reactivity to Omp31 from Brucella melitensis in human and animal infections by smooth and rough Brucellae. Clin Diagn Lab Immunol 2004; 11(1): 111-4.
  37. Marshall NJ, Goodwin CJ, Holt SJ. A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regul 1995; 5(2): 69-84.
  38. Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res 1988; 48(17): 4827-33.
  39. Liu SB, Hu PZ, Hou Y, Li P, Cao W, Tian Q. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes the proliferation of mesenchymal stem cells in vivo and in vitro. Chin Med J (Engl) 2009; 122(7): 839-43.
  40. Ghasemi A, Zarnani AH, Ghoodjani A, Rezania S, Salari MH, Jeddi-Tehrani M. Identification of a new immunogenic candidate conferring protection against Brucella melitensis infection in Mice. Mol Immunol. 2014; 62(1): 142-9.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 292 - شماره پیاپی 292
مرداد و شهریور 1393
صفحه 1036-1045

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 25 آبان 1392
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار