امکان شناسایی آنتی‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B (HBsAg) به روش Enzyme-Linked Aptamer Assay و مقایسه‌ی آن با روش Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 دانشیار، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

3 دکتری تخصصی، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 دانشجوی دکتری، مرکز تحقیقات قلب و عروق، پژوهشکده‌ی قلب و عروق اصفهان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

5 دانشیار، بخش تولید واکسن هپاتیت ب، مجتمع تولیدی- تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: کیت‌های تشخیص بالینی ویروس هپاتیت B، بر اساس آنتی‌بادی می‌باشند و از نظر حساسیت، پایداری و هزینه دارای نواقصی هستند. از این رو، تحقیقات در جهت جایگزینی آپتامرها به جای آنتی‌بادی شاید این نواقص را جبران کند. در این مطالعه، از آپتامر بیوتینه در بررسی امکان شناسایی اختصاصی Hepatitis B surface antigen (HBsAg) با سیستم بیوتین- استرپتاویدین و روش Enzyme-linked aptamer assay (ELAA) استفاده شد.روش‌ها: HBsAg به وسیله‌ی بافر کربنات- بی‌کربنات دارای pH معادل 4/9 با در نظرگیری متغیرهای مختلف در پلیت Maxibinding (SPL, Korea) تثبیت شد. تثبیت HBsAg با کیت ELISA تجاری بررسی شد. قطعه‌ی آپتامر کلون شد و از پلاسمید به عنوان DNA الگو در Imbalance polymerase chain reaction (Imbalance PCR) جهت تولید DNA تک رشته‌ای استفاده و این روش بهینه شد. از آپتامر بیوتینه با استفاده از سیستم استرپتاویدین- بیوتین در روش ELAA استفاده شد.یافته‌ها: تثبیت آنتی‌ژن با استفاده از کونژوگه‌ی 1 و 2 کیت تجاری اثبات شد. کلونینگ قطعه‌ی آپتامر در Escherichia coli Top10 (E. coli Top10) توسط Colony PCR تأیید شد. بهترین نتیجه‌ی PCR گرادیان دمای اتصال پرایمر در 64 درجه‌ی سانتی‌گراد بود. گروه شاهد آزمایش‌ها، گویای تثبیت صحیح آنتی‌ژن بود، اما هر دو آپتامر سنتتیک و آپتامر Imbalance PCR، سیگنال‌های تکرارپذیر و اختصاصی مبین شناسایی و اتصال آپتامر به HBsAg را نشان ندادند.نتیجه‌گیری: در هنگام تثبیت آنتی‌ژن، ساختار آن نسبت به آنتی‌ژن موجود در سطح ویروس یا سلول تغییر می‌کند. شاید علت نتایج منفی، توانایی آپتامر در شناسایی آنتی‌ژن با ساختار دست نخورده باشد. همچنین، احتمال می‌رود اتصال بیوتین به آپتامر، موجب تداخل در ساختار آن شود و استفاده از بازوی رابط بین افزونه و آپتامر نیاز به بررسی دارد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Using Enzyme-Linked Aptamer Assay to Detect Hepatitis B Surface Antigen in Comparison to Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

نویسندگان [English]

  • Hamidreza Mianesaz 1
  • Hossein Khanahmad 2
  • Mina Mirian 3
  • Maryam Boshtam 4
  • Seyed Nezamoddin Hoseini 5
1 MSc Student, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Associate Professor, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 PhD, Department of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy, Isfahan University of Medical Science, Isfahan, Iran
4 PhD Candidate, Isfahan Cardiovascular Research Center, Cardiovascular Research Institute, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
5 Associate Professor, Hepatitis B Vaccine Production Section, The Production and Research Complex, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Clinical diagnostic kits for detecting hepatitis B are based on antibodies, and have inefficient sensitivity, stability, and cost. Therefore, researches about aptamers and using them instead of antibodies may make these defects up. In this study, a biotinylated anti-hepatitis B virus surface antigen (anti-HBsAg) aptamer sequence was used to evaluate the possibility of specific detection of HBsAg via enzyme-linked aptamer assay (ELAA) method using biotin-streptavidin system.Methods: HBsAg was immobilized in Maxibinding plate (SPL, Korea) by using carbonate-bicarbonate buffer (pH: 9.4), and by considering different variables. Immobilization of HBsAg was evaluated by commercial kit. Aptamer sequence was cloned and imbalance polymerase chain reaction (PCR) was improved and performed using plasmid as DNA template. Then, biotinylated aptamer was utilized in enzyme-linked aptamer assay method via taking advantage of streptavidin-biotin signal amplification system.Findings: Antigen immobilization was set up using conjugates number 1 and 2 of commercial kit. Colony polymerase chain reaction confirmed aptamer cloning in Escherichia coli (E. coli) Top10 host. The best gradient polymerase chain reaction result was achieved at 64 ºC annealing temperature. Control group in assays showed accuracy of immobilization; but no repetitive specific signal was obtained that could prove joining of aptamer to HBsAg, and detection of that.Conclusion: Three-dimensional structure of an immobilized antigen on a solid surface may vary from that which exists on the surface of viruses or cells. Negative results might be due to the ability of aptamers to attach into antigens with totally intact shape. Conjugation of aptamer with biotin may interfere in aptamer conformation; so, a connective arm between aptamer and biotin could be a suggestion, which needs more assessments.

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA aptamers
  • Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Hepatitis B
  • Hepatitis B surface antigens

مراجع

  1. Poorolajal J, Majdzadeh R. Prevalence of chronic hepatitis B infection in Iran: A review article. J Res Med Sci 2009; 14(4): 249-58
  2. World Health Organization.Global hepatitis report, 2017. Geneva, Switzerland: WHO; 2017.
  3. Zidan A, Scheuerlein H, Schule S, Settmacher U, Rauchfuss F. Epidemiological pattern of hepatitis B and hepatitis C as etiological agents for hepatocellular carcinoma in Iran and worldwide. Hepat Mon 2012; 12(10 HCC): e6894.
  4. Kidd-Ljunggren K, Myhre E, Blackberg J. Clinical and serological variation between patients infected with different Hepatitis B virus genotypes. J Clin Microbiol 2004; 42(12): 5837-41.
  5. Pishtaz Teb. HBsAg ELISA kit [Online]. Available from: URL: http://www.pishtazteb.com/product/p25-HBs-Ag
  6. Jayasena SD. Aptamers: An emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin Chem 1999; 45(9): 1628-50.
  7. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249(4968): 505-10.
  8. Zhu Q, Liu G, Kai M. DNA aptamers in the diagnosis and treatment of human diseases. Molecules 2015; 20(12): 20979-97.
  9. Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 1992; 355(6360): 564-6.
  10. Nussbaum O. Nucleic acid aptamer-based diagnostic methods with novel techniques for signal enhancement [Patent: EP2591107A2]. 2013.
  11. Thermo Scientific. ELISA technical guide and protocols (TECH TIP # 65) [Online]. [cited 2017]; Available from: URL: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TR0065-ELISA-guide.pdf
  12. Mayer G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl 2009; 48(15): 2672-89.
  13. Barthelmebs L, Jonca J, Hayat A, Prieto-Simon B, Marty JL. Enzyme-Linked Aptamer Assays (ELAAs), based on a competition format for a rapid and sensitive detection of Ochratoxin A in wine. Food Control 2011; 22(5): 737-43.
  14. Lee SJ, Park JW, Kim IA, Youn BS, Gu MB. Sensitive detection of adipokines for early diagnosis of type 2 diabetes using enzyme-linked antibody-aptamer sandwich (ELAAS) assays. Sens Actuators B Chem 2012; 168: 243-8.
  15. Gu H, Duan N, Wu S, Hao L, Xia Y, Ma X, et al. Graphene oxide-assisted non-immobilized SELEX of okdaic acid aptamer and the analytical application of aptasensor. Sci Rep 2016; 6: 21665.
  16. Fu P, Sun Z, Yu Z, Zhang Y, Shen J, Zhang H, et al. Enzyme-linked aptamer assay: based on a competition format for sensitive detection of antibodies to Mycoplasma bovis in serum. Anal Chem 2014; 86(3): 1701-9.
  17. Chen LC, Yang DK, Hsu CH, Lee MY. Aptamer for detection of alpha-methylacyl-coa racemase and diagnostic kit thereof [Patent: US20160177397A1]. 2016.
  18. Penner G. Commercialization of an Aptamer-Based Diagnostic Test [Online]. [cited 2012 5 Sep]; Available from: URL: https://www.mddionline.com/commercialization-aptamer-based-diagnostic-test
  19. Xi Z, Huang R, Li Z, He N, Wang T, Su E, et al. Selection of HBsAg-specific DNA aptamers based on carboxylated magnetic nanoparticles and their application in the rapid and simple detection of hepatitis B virus infection. ACS Appl Mater Interfaces 2015; 7(21): 11215-23.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 36، شماره 471 - شماره پیاپی 471
فروردین و اردیبهشت 1397
صفحه 233-240

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 07 اسفند 1396
  • تاریخ بازنگری: 11 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار