بررسی پایداری کیت ELISA آنتی‌ژن B نوترکیب اکینوکوکوس گرانولوزوس با استفاده از روش‌های فیزیکی و باکتریواستاتیک

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه انگل‌ و قارچ‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 استاد، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی و گروه بیوتکنولوژی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

3 استادیار، گروه انگل و قارچ شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 استادیار، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی و گروه بیوتکنولوژی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: کیست هیداتید، عامل هیداتیدوز، یک بیماری زئونوز است که توسط مرحله‌ی لاروی گونه‌های مختلف سستود اکینوکوک، اغلب به صورت کیسه‌های پر از مایع، در بافت‌های مختلف بدن ایجاد می‌شود. تشخیص این بیماری در انسان به روش‌های گوناگونی انجام می‌گردد که یکی از رایج‌ترین آن‌ها‌ روش ELISA می‌باشد. یکی از ترکیبات اصلی آنتی‌ژنیک مایع کیست هیداتیک اکینوکوکوس گرانولوزوس، آنتی‌ژن B است.روش‌ها: برای تهیه‌ی کیت، ابتدا ژن کدکننده‌ی آنتی‌ژن B در وکتور بیانی کلون و سپس، بیان و خالص گردید و در انتها، به عنوان آنتی‌ژن اصلی در چاهک‌های ELISA پوشش داده شد. در این مطالعه، با استفاده از روش‌های استاندارد، پایداری فیزیکی و باکتریواستاتیک کیت ELISA آنتی‌ژن نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. سنجش پایداری فیزیکی با استفاده از تست پایداری تسریع شده (نسبت Arrhenius) صورت گرفت. برای انجام، تعداد مشخصی نمونه‌ی مثبت و منفی، ابتدا با کیت مورد نظر سنجش شد؛ سپس، کیت در شرایط دمایی خاص و زمان معین قرار گرفت و بار دیگر، نمونه‌های قبلی با این کیت مورد سنجش قرار گرفت و درصد پایداری آن‌ها مشخص شد. سنجش پایداری باکتریواستاتیک، با استفاده از مواد نگه‌دارنده مانند سدیم آزاید و پروکلین 300، در غلظت‌های متفاوت با استفاده از باکتری باسیلوس سوبتیلیس صورت گرفت. برای انجام این مرحله، ابتدا غلظت‌های متفاوت از باکتری و درصدهای متفاوت از مواد نگه‌دارنده را تهیه شد؛ سپس، به محلول‌های داخل کیت اضافه گردید و اثر ضدمیکروبی آن‌ها بررسی شد تا کمترین درصد نگه‌دارنده که بیشترین خاصیت باکتریواستاتیکی را دارد، مشخص گردید.یافته‌ها: بر اساس تست‌های پایداری فیزیکی، کیت طراحی شده دارای پایداری یک ساله و عدم پایداری دو ساله در دمای 8-2 درجه‌ی سانتی‌گراد (یخچال) بود. بر اساس سنجش پایداری باکتریواستاتیک، سدیم آزاید اثر تخریبی بر روی محلول‌های داخل کیت داشت ولی، پروکلین 300 با غلظت 05/0 درصد کمترین اثر تخربی را دارا بود.نتیجه‌گیری: مطالعات پایداری فیزیکی و باکتریواستاتیک انجام شده نشان داد که کیت طراحی شده با آنتی‌ژن B نوترکیب و حاوی نگه‌دارنده‌ی پروکلین 300 با غلظت 05/0 درصد، برای مدت زمان یک سال در دمای 8-2 سانتی‌گراد پایدار است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Stability Determination of Recombinant Echinococcus Granulosus Antigen B Kit by Physical and Bacteriostatical Methods

نویسندگان [English]

  • Ensiyeh Davoudabadi 1
  • Bahram Kazemi 2
  • Behzad Hagh-Panah 3
  • Mojgan Bandehpour 4
  • Mehran Bahadoran 3
  • Maryam Moradi 1
  • Sanaz Gholami 1
1 MSc Student, Department of Parasitology and Mycology, School of Medicine AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Professor, Cellular and Molecular Biology Research Center AND Department of Biotechnology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 Assistant Professor, Department of Parasitology and Mycology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4 Assistant Professor, Cellular and Molecular Biology Research Center AND Department of Biotechnology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Cystic hydatidosis disease (CHD) is a common disease of human and animal caused by contamination with the metacestode stage of echinococcus granulosus. The disease causes cyst in tissue body of patients. Antigen B is one of the important antigens in liquid cyst.Methods: Expressed and purified recombinant antigen of echinococcus granulosus was used as antigen in ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method. The handmade kit was studied with physical and bacteriostatical methods. Physical stability was assessed with accelerated stability test (Arrhenius equation). First, numeral negative and positive samples were evaluated; then, the kit was exposed in special temperatures and times; afterwards, the samples were evaluated again and compared with the first evaluation. Proclin300, Soduim azide and Bacillus subtilis were chosen in bacteriostatic method. Different concentration of bacillus and different percents of preservatives were added to solutions of the kit. Growth of bacteria was evaluated and the least percent of preservatives that had the most effect of bacteriostatic was determinated.Findings: According to stability test, the handmade kit had one-year stability and do not have stability for two years in the 2-8ºC tempreture. Sodium azide had destructive effect on solutions of the kit; but, proclin300 with the concentration of 0.05% was appropriate for solutions.Conclusion: Stability and bacteriostatic methods showed that the handmade kit can be maintained in 2-8ºC with significant activity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Echinococcus granulosus
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)
  • Recombinant antigen B
  • Physical methods
  • Bacteriostatic methods

مراجع

  1. Athari A, Ansari N, Ourmazdi H, Bijan H, Janbakhsh B, Haghighi A. Essential of medical helminthology-manifestation and treatment of the diseases. 1st ed. Tehran, Iran: Noor Danesh Publication; 2003. [In Persian].
  2. Arfaa F. Medical helmintology. 5th ed. Tehran, Iran: Keshavarz Publication; 2002. [In Persian].
  3. Ghafarifar F, Dalimi-Asl A, Jalosian F. Evaluation of DIG-ELISA for diagnosis of human hydatidosis. Journal of Medical Science: Pathobioligy 2001; 4(3-4): 145-56. [In Persian].
  4. Salami SH, Dalimi A, Madani R. Invention and evaluation of dot ELISA for human hydatidosis diagnosis. Daneshvar Med 1999; 6(24): 37-40. [In Persian].
  5. Thompson RC, Lymbery AJ. Echinococcus and hydatid disease. New York, NY: CABI; 1995. p. 411-63.
  6. Ortona E, Rigano R, Margutti P, Notargiacomo S, Ioppolo S, Vaccari S, et al. Native and recombinant antigens in the immunodiagnosis of human cystic echinococcosis. Parasite Immunol 2000; 22(11): 553-9.
  7. Rigano R, Profumo E, Bruschi F, Carulli G, Azzara A, Ioppolo S, et al. Modulation of human immune response by Echinococcus granulosus antigen B and its possible role in evading host defenses. Infect Immun 2001; 69(1): 288-96.
  8. Abdi J, Kazemi B, Mohebali M, Bandehpour M, Rahimi MT, Rokni MB. Gene cloning, expression and serological evaluation of the 12-kDa antigen-B subunit from Echinococcus granulosus. Ann Trop Med Parasitol 2010; 104(5): 399-407.
  9. Sambrook JJ, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Long Island, NY: CSHL Press; 2001. p. 1-3.
  10. Promega. Instructions for use of product p2211 and 2551. Technical Bulleint No.253 [Online] 2006. Available from: URL: http://www.yrgene.com/sites/default/files/documents/vector/tb253.pdf
  11. Bandehpour M, Seyed N, Shadnoush M, Pakzad P, Kazemi B. Using recombinant Chlamydia major outer membrane protein (MOMP) in ELISA diagnostic kit. Iran J Biotech 2006; 4(4): 239-44.
  12. Wang Y, Schwarz S, Shen Z, Zhang W, Qi J, Liu Y, et al. Co-location of the multiresistance gene cfr and the novel streptomycin resistance gene aadY on a small plasmid in a porcine Bacillus strain. J Antimicrob Chemother 2012; 67(6): 1547-9.
  13. Vasanthakumari R. Textbook of microbiology. In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM, Editors. Bailey and Scott's diagnostic microbiology. New Delhi, DL: BI Publications Pvt Ltd; 2007.
  14. Müller R. Worms and human disease. Uganda, Africa: CABI; 2002. p. 85-93.
  15. Mamuti W, Yamasaki H, Sako Y, Nakao M, Xiao N, Nakaya K, et al. Molecular cloning, expression, and serological evaluation of an 8-kilodalton subunit of antigen B from Echinococcus multilocularis. J Clin Microbiol 2004; 42(3): 1082-8.
  16. Sarkari B, Sadjjadi SM, Abidi H, Izadpanah A, Kazemian S, Rafati A. Application of Western Blotting Using Native Antigen B for Serodiagnosis of Human Cystic Echinococcosis. Iranian Journal of Parasitology 2007; 2(3): 7-12.
  17. Kalantari E, Bandehpour M, Pazoki R, Taghipoor-Lailabadi N, Khazan H, Mosaffa N, et al. Application of recombinant Echinococcus granulosus antigen B to ELISA kits for diagnosing hydatidosis. Parasitol Res 2010; 106(4): 847-51.
  18. Magari RT, Murphy KP, Fernandez T. Accelerated stability model for predicting shelf-life. J Clin Lab Anal 2002; 16(5): 221-6.
  19. De Vore K. Have more confidence in your stability data: two points to consider. J Pharm Biomed Anal 2006; 41(1): 293-8.
  20. Hornback LA. Stability testing for IVDs [Online] 2004; Available from: URL: http://www.ivdtechnology.com/article/stability-testing-ivds/
  21. Morris JW. A comparison of linear and exponential models for drug expiry estimation. J Biopharm Stat 1992; 2(1): 83-90.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 31، شماره 237 - شماره پیاپی 237
خرداد و تیر 1392
صفحه 701-711

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 26 مرداد 1391
  • تاریخ بازنگری: 12 آبان 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار