نوع مقاله : مقاله های پژوهشی
نویسندگان
1
گروه علوم تشریحی و بیولوژی ملکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
2
استادیار، گروه ژنتیک و بیولوژی ملکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
3
استادیار، گروه علوم تشریحی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
4
گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان
5
دانشیار، گروه آمار و اپیدمیولوژی، دانشکده‌ی بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
مقدمه: بهینه‌سازی تولید اینترفرون بتا در سلول‌های CHO (Chinese hamster ovary) به عنوان یک میزبان بیانی که قادر به تولید پروتئین دارویی با کیفیت بالا می‌باشد، جهت کاهش قیمت و سرعت تولید این پروتئین نوترکیب دارویی از اهمیت زیادی برخوردار است. هدف این مطالعه، بررسی تأثیر پایداری mRNA به واسطه‌ی ایجاد یک تغییر در اولویت کدونی در ناحیه‌ی ناپایدارکننده‌ی انتهای پروتئین اینترفرون بتا (CRID یا Coding region instability determinant) و بررسی اثر این موتاسیون‌ها بر روی میزان بیان‌گذرای سلول‌های CHO به عنوان فاکتوری در راستای بهبود بیان ژن بود. روش‌ها: با استفاده از جدول اولویت کدونی (هامستر چینی) Cricetulus griseus 4 موتاسیون مورد نیاز برای ایجاد یک اولویت کدونی در توالی CRID ژن اینترفرون بتای انسانی طراحی شد. با روش SOEing PCR (Polymerase chain reaction-splicing by overlapping extension) در ناحیه‌ی CRID از ژن اینترفرون بتا موتاسیون‌های مورد نظر ایجاد شد و به وسیله‌ی کیت ®Express in درون سلول‌های CHO ترانسفکت گردید. میانگین میزان اینترفرون بتای تولید شده توسط سلول‌های CHO ترانسفکت شده با ژن موتانت اینترفرون بتا با استفاده از کیت ELISA مخصوص این ماده با میانگین میزان اینترفرون بتای تولید شده توسط سلول‌های CHO ترانسفکت شده با ژن طبیعی مقایسه گردید. یافته‌ها: موتاسیون‌های انجام شده به وسیله‌ی بررسی ژل و توالی‌یابی قطعات حاصل تأیید گردید. موتاسیون‌های حاصل جهت ایجاد یک اولویت کدونی در توالی CRID پس از تراسفکت کردن ژن موتانت در سلول‌های CHO سبب افزایش معنی‌دار 9/2 برابری (05/0 > P) در میزان اینترفرون بتای تولید شده توسط سلول‌های CHO ترانسفکت شده با ژن موتانت نسبت به میزان اینترفرون بتای تولید شده توسط سلول‌های CHO ترانسفکت شده با ژن طبیعی گردید. نتیجه‌گیری: موتاسیون‌های مدنظر با موفقیت انجام گردید و نشان داده شد که انجام این جهش‌ها در توالی ناپایدار کننده‌ی انتهایی CRID می‌تواند به صورت معنی‌داری باعث افزایش پایداری و در نتیجه افزایش غلظت اینترفرون تولید شده در محیط کشت شود. این موتاسیون‌ها جدید بودند و تأثیر قابل توجه آن‌ها نیز به اثبات رسید. در مجموع، نتایج این تحقیق جالب توجه و کاربردی به نظر می‌رسد. واژگان کلیدی: اینترفرون بتا، واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، Codon Bias، CRID
عنوان مقاله [English]
Improvement of Interferon-Beta Production in Transient Expression System of CHO DG44 by a Codon Bias Change in Instability Sequence (CRID) of C-terminal of Interferon Beta Gene
نویسندگان [English]
-
Zahra Bezi
1
-
Hassan Korbekandi
2
-
Batool Hashemibeni
3
-
Zohreh Hojjati
4
-
Amin Moradi Hassanabad
1
-
Mohammad Reza Marasi
5
1
Department of Anatomy and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2
Assistant Professor, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3
Assistant Professor, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4
Department of Biology, School of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
5
Associate Professor, Department of Epidemiology, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Background: Improvement of mRNA stability and therefore, production of interferon beta (IFNb) in Chinese hamster ovary (CHO) cell, as a recombinant protein expression system, is very important. The aim of this study was to investigate this effect by creating a codon bias change in instability sequence located in C-terminal of interferon beta protein (Coding region instability determinant or CRID). Methods: Mutations were designed in 4 points, according to codon bias table of Cricetulus griseus, using polymerase chain reaction/splicing by overlapping extension (SOEing PCR) method inside the CRID of interferon beta gene. The concentration of interferon beta in the medium of Chinese hamster ovary cell was determined using ELISA test kit. Findings: The mutations were verified by gel-electrophoresis and sequencing the resultant DNA. The mutations in resulted in a significant (2.9 times) increase in interferon-b concentration (P < 0.05). Conclusion: The mutations in CRID could significantly increase the stability of mRNA and the resultant Interferon b concentration in the medium. These mutations were novel and their effectiveness was proved. Keywords: Interferon beta, Polymerase chain reaction/splicing by overlapping extension (SOEing PCR), C-terminal of interferon beta protein (CRID), Codon bias, Chinese hamster ovary
)