طراحی و ساخت واکسن خوراکی مبتنی بر لاکتوکوکوس لاکتیس نوترکیب بیان کننده‌ی پروتئین سیتوپلاسمی لومازین سنتاز علیه بروسلا آبورتوس

نوع مقاله : Original Article(s)

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه زیست شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

2 استاد، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

3 استادیار، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

چکیده

مقاله پژوهشی




مقدمه: واکسیناسیون، یکی از مؤثرترین و اقتصادی‌ترین روش‌ها برای کنترل بروسلوز می‌باشد. هدف از این پژوهش، ایجاد باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس نوترکیب بیان‌کننده پروتئین سیتوپلاسمی لومازین سنتاز (Brucella lumazine synthase) BLS بروسلا آبورتوس می‌باشد.
روش‌ها: در این مطالعه، وکتور مورد نظر به همراه ژن و سیگنال پپتید (pNZ8148-Usp45-BLS) طراحی و سنتز گردید. به منظور تأیید صحت کلونینگ از روش واکشن زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction) PCR، هضم آنزیمی و توالی‌یابی استفاده شد. سپس وکتور بیانی نوترکیب به باکتری اشریشیاکلی سویه Top10 F ترانسفورم شد. باکتری‌های ترانسفورم شده که بر روی پلیت آگار حاوی کلرامفنیکل رشد کرده بودند، انتخاب شده و با استفاده از کیت استخراج پلاسمید ستونی، استخراج انجام شد. با استفاده از تکنیک الکتروپوریشن، وکتور نوترکیب درون باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس ترانسفورم شد. به منظور تأیید ترانسفورماسیون از تکنیک ژل الکتروفورز عمودی (Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis = SDS-PAGE) و (Reverse transcription polymerase chain reaction)
RT-PCR استفاده شد.
یافته‌ها: هضم آنزیم، PCR و توالی‌یابی به منظور تأیید کلونینگ ژن BLS در وکتور pNZ8148 انجام شد. مشاهده‌ی قطعه‌ی ژنیBLS  با طولی برابر 477 جفت باز و قطعه پلاسمید pNZ8148 - Usp45 فاقد قطعه‌ی ژنی BLS با طول 2997 جفت باز،کلون‌سازی قطعه‌ی ژنی BLS تأیید شد. نتایج توالی‌یابی توسط شرکت Generay ارسال شد. همچنین در بررسی انجام شده توسط دستگاه نانودراپ غلظت پلاسمید استخراج شده  ng/µl848/9 و درجه‌ی خلوص 2/07 برآورد شد. نتایج حاصل از RT-PCR حاکی از موفقیت در ترانسفورماسیون ژن BLS بروسلا آبورتوس در باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس بود. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از وجود تک باند 18 کیلودالتونی پروتئین BLS بود.
نتیجه‌گیری: پژوهش حاضر نشان داد که ژن BLS باکتری پروبیوتیک لاکتوکوکوس لاکتیس ترانسفورم شده با pNZ8148-Usp45-BLS به روش الکتروپوریشن، بیان می‌شود.

تازه های تحقیق

عباس دوستی: Google Scholar

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Design and Fabrication of a DNA Vaccine against Brucella Abortus based on recombinant Lactococcus Lactis that Expresses Lumazine Synthase Protein

نویسندگان [English]

  • Zahra Fatehi 1
  • Abbas Doosti 2
  • Mohammad Saeid Jami 3
1 PhD Student, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
2 Professor, Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
3 Assistant Professor, Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
چکیده [English]

Background: Vaccination is an efficient and cost-effective way to control brucellosis. This study aims to generate recombinant Lactococcus lactis (L. lactis) with Brucella abortus (B. abortus) BLS cytoplasmic protein.
Methods: The target vector, gene, and signal peptide (pNZ8148-Usp45-BLS) were developed and made in this study. Cloning accuracy was verified by PCR, enzyme digestion, and sequencing. Top10 F Escherichia coli was transformed using the recombinant expression vector. The column plasmid extraction kit selected and eliminated chloramphenicol-effected bacteria from an agar plate. In electroporation, Lactococcus lactis bacteria received the recombinant vector. Both SDS-PAGE and RT-PCR confirmed the transition.
Findings: To confirm the correctness of cloning and to confirm the presence of the BLS gene in the pNZ8148 vector, PCR and enzymatic digestion were performed. Observation of the BLS gene fragment with a length of 477 bp and plasmid pNZ8148 - Usp45 without the BLS gene fragment with a length of 2997 bp, the cloning of the BLS gene fragment was confirmed. Also, in the study conducted by the nanodrop device, the concentration of the extracted plasmid was estimated at 848.9 ng/µl and the degree of purity was 2.07. The results of RT-PCR indicated the success of the BLS gene transformation of Brucella abortus in L. lactis bacteria. Also, a single protein band of 18 kDa was observed in transformed L. lactis.
Conclusion: The present study showed that the BLS gene of the probiotic L. lactis transfected with pNZ8148-Usp45-BLS is expressed by electroporation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Brucellosis
  • DNA vaccine
  • Lactococcus lactis
  • Electroporation

مراجع

  1. Dadar M, Tiwari R, Sharun K, Dhama K. Importance of brucellosis control programs of livestock on the improvement of one health. Vet Q 2021; 41(1): 137-51.
  2. Vitry MA, Hanot Mambres D, De Trez C, Akira S, Ryffel B, Letesson JJ, et al. Humoral immunity and CD4+ Th1 cells are both necessary for a fully protective immune response upon secondary infection with Brucella melitensis. J Immunol 2014; 192(8): 3740-52.
  3. Darbandi A, Koupaei M, Navidifar T, Shahroodian S, Heidary M, Talebi M. Brucellosis control methods with an emphasis on vaccination: a systematic review. Expert Rev Anti Infect Ther 2022; 20(7): 1025-35.
  4. Shirdast H, Ebrahimzadeh F, Taromchi AH, Mortazavi Y, Esmaeilzadeh A, Sekhavati MH, et al. Recombinant Lactococcus lactis displaying Omp31 antigen of Brucella melitensis can induce an immunogenic response in BALB/c mice. Probiotics Antimicrob Proteins 2021; 13(1): 80-9.
  5. Yousefi S, Abbassi-Daloii T, Sekhavati MH, Tahmoorespur M. Evaluation of immune responses induced by polymeric OMP25-BLS Brucella antigen. Microb Pathog 2018; 115: 50-6.
  6. Velikovsky CA, Cassataro J, Giambartolomei GH, Goldbaum FA, Estein S, Bowden RA, et al. A DNA vaccine encoding lumazine synthase from Brucella abortus induces protective immunity in BALB/c mice. Infect Immun 2002; 70(5): 2507-11.
  7. Skwarczynski M, Toth I. Non-invasive mucosal vaccine delivery: advantages, challenges and the future. Expert Opin Drug Deliv 2020; 17(4): 435-7.
  8. Rueckert C, Guzmán CA. Vaccines: From empirical development to rational design. PLoS Pathog 2012;
    8(11): e1003001.
  9. Szatraj K, Szczepankowska AK, Chmielewska-Jeznach M. Lactic acid bacteria - promising vaccine vectors: possibilities, limitations, doubts. J Appl Microbiol 2017; 123(2): 325-39.
  10. de Castro CP, Drumond MM, Batista VL, Nunes A, Mancha-Agresti P, Azevedo V. Vector development timeline for mucosal vaccination and treatment of disease using Lactococcus lactis and design approaches of next generation food grade plasmids. Front Microbiol 2018; 9: 1805.
  11. Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1972; 69(8): 2110-4.
  12. Mahmoudi Vashian Z, Doosti Z. Cloning and gene expression of ureG gene as a DNA vaccine candidate against helicobacter pylori [in Persian]. J Guilan Univ Med Sci 2017; 26(102): 20-9.
  13. Al-Dosari MS, Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. AAPS 2009; 11(4): 671.
  14. da Silva AJ, Zangirolami TC, Novo-Mansur MTM, de Campos Giordano R, Martins EAL. Live bacterial vaccine vectors: an overview. Braz J Microbiol 2014; 45(4): 1117-29.
  15. Pasquevich KA, Ibañez AE, Coria LM, García Samartino C, Estein SM, Zwerdling A, et al. An oral vaccine based on U-Omp19 induces protection against B. abortus mucosal challenge by inducing an adaptive IL-17 immune response in mice. PLoS One 2011; 6(1): e16203.
  16. Sanakkayala N, Sokolovska A, Gulani J, HogenEsch H, Sriranganathan N, Boyle SM, et al. Induction of antigen-specific Th1-type immune responses by gamma-irradiated recombinantBrucella abortusRB51. Clin Vaccine Immunol 2005; 12(12): 1429-36.
  17. Velikovsky CA, Goldbaum FA, Cassataro J, Estein S, Bowden RA, Bruno L, et al. Brucellalumazine synthase elicits a mixed Th1-Th2 immune response and reduces infection in mice challenged withBrucella abortus544 independently of the adjuvant formulation used. Infect Immun 2003; 71(10): 5750-5.
  18. Zhao Z, Li M, Luo D, Xing L, Wu S, Duan Y, et al. Protection of mice from Brucella infection by immunization with attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium expressing A L7/L12 and BLS fusion antigen of Brucella. Vaccine 2009; 27(38): 5214-9.
  19. Leya M, Kim WK, Cho JS, Yu EC, Kim YJ, Yeo Y, et al. Vaccination of goats with a combinationSalmonellavector expressing fourBrucellaantigens (BLS, PrpA, Omp19, and SOD) confers protection againstBrucella abortusinfection. J Vet Sci 2018; 19(5): 643-52.
  20. Rezaei M, Rabbani Khorasgani M, Aliramaei MR. Recombinant lactococcus, a new approach to oral vaccines [in Persian]. J Arak Univ Med Sci 2020, 23(6): 786-805.‏
  21. Diaz-Dinamarca DA, Hernandez C, Escobar DF, Soto DA, Muñoz GA, Badilla JF, et al. Mucosal vaccination with Lactococcus lactis-secreting surface immunological protein induces humoral and cellular immune protection against group B Streptococcus in a Murine model. Vaccines (Basel) 2020; 8(2): 146.
  22. Rezaei M, Rabbani-Khorasgani M, Zarkesh-Esfahani SH, Emamzadeh R, Abtahi H. Lactococcus-based vaccine against brucellosis: IgG immune response in mice with rOmp16-IL2 fusion protein. Arch Microbiol 2021; 203(5): 2591-6.‏
  23. Mohammadi E, Golchin M. High protection of mice against Brucella abortus by oral immunization with recombinant probiotic Lactobacillus casei vector vaccine, expressing the outer membrane protein OMP19 of Brucella species. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2020; 70: 101470.
  24. Sáez D, Fernández P, Rivera A, Andrews E, Oñate A. Oral immunization of mice with recombinant Lactococcus lactis expressing Cu, Zn superoxide dismutase of Brucella abortus triggers protective immunity. Vaccine 2012; 30(7): 1283-90.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 41، شماره 738
هفته 2، آذر
آذر و دی 1402
صفحه 872-883

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 01 بهمن 1401
  • تاریخ بازنگری: 01 آذر 1402
  • تاریخ پذیرش: 04 آذر 1402

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار