نوع مقاله : مقاله های پژوهشی
نویسندگان
1
دانشجوی دکتری، گروه مهندسی بافت، دانشکده‌ی فناوریهای نوین، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
2
استادیار، گروه آناتومی و بیولوژی ملکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
3
دانشجوی پزشکی، دانشکده‌ی پزشکی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
4
دانشجوی دکتری، گروه آناتومی و بیولوژی ملکولی، دانشکده‌ی پزشکی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
5
استاد، گروه جراحی مغز و اعصاب، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
6
دانشیار، گروه ایمونولوژی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
مقدمه: دژنره شدن دیسک بین مهره‌ای در اثر کاهش تعداد سلول‌ها، کاهش تولید و تخریب ماتریکس خارج سلولی بافت دیسک بین مهره‌ای به خصوص در ناحیه‌ی نکلئوس پالپوزوس (NP) ایجاد می‌شود. در مهندسی بافت از داربست‌های طبیعی و غیر طبیعی مختلف برای ترمیم و رژنره شدن دیسک بین مهره‌ای استفاده می‌گردد. داربست‌های مورد استفاده باید تخریب پذیر و زیست سازگار باشند و محیط مناسبی برای تکثیر و مهاجرت سلول‌ها فراهم کنند. کیتوسان-ژلاتین و آلژینات از داربست‌های طبیعی خوبی هستند که برای این منظور مناسب هستند. برای شناسایی سلول‌های NP مارکر و روش خاصی وجود ندارد ولی بعضی مطالعات گزارش‌هایی از بیان بالای مارکرهای سیتوکراتین 19، 18 و 8 توسط تکنیک‌های Real time و ایمنوسیتوشیمی در سلول‌های NP منتشر کرده‌اند. هدف از این مطالعه شناسایی سلول‌های NP دیسک بین مهره‌ای انسانی توسط فلوسایتومتری مارکر سیتوکراتین 18، مقایسه‌ی میزان بقا، تکثیر و مورفولوژی سلول‌های NP در دو داربست آلژینات و کیتوسان-ژلاتین بود. روش‌ها: سلول‌های NP با تجزیه‌ی آنزیمی کلاژناز از بافت NP بیماران مبتلا به فتق دیسک بین مهره‌ای در بیمارستان الزهرای (س) اصفهان تهیه شد. محلول کیتوسان با محلول ژلاتین مخلوط شد. پس از ایجاد ارتباط بین این دو محلول توسط گلوتارآلدیید، مخلوط حاصل پس از فریز کردن و Freeze-drying به عنوان داربست مورد استفاده قرار گرفت. داربست آلژینات نیز تهیه گردید. پس از تأیید NP بودن سلول‌های جدا شده توسط فلوسایتومتری کردن مارکر درون سلولی سیتوکراتین-18، سوسپانسیون سلولی حاوی سلول‌های NP جدا شده به دو داربست منتقل گردید و تا 21 روز کشت داده شدند. برای بررسی درصد سلول‌های زنده و میزان تکثیر از تکنیک‌های تریپان بلو و MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2,5-Diphenyltetrazolium bromide] استفاده گردید. برای اثبات وجود منافذ و بررسی ساختار داربست و مورفولوژی سلول‌ها نیز از میکروسکوپ SEM (Scaning electron microscop) استفاده شد. یافته‌ها: نتایج فلوسایتومتری نشان داد که 60 سلول زنده مارکر سیتوکراتین 18 را بیان می‌کنند. نتایج MTT نیز نشان داد که درصد سلول‌های زنده در روز سوم نسبت به روز اول در هر دو داربست آلژینات و کیتوسان-ژلاتین اختلاف معنی‌داری داشت. همچنین درصد سلول‌های زنده از روز 3 تا 21 به صورت معنی‌داری کاهش یافت. نتایج شمارش سلول‌ها نشان داد که اختلاف میانگین تعداد سلول‌ها در داربست آلژینات به صورت معنی‌داری بیشتر از داربست کیتوسان-ژلاتین بود (001/0 > P). نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که می‌توان از مارکر سیتوکراتین 18 توسط فلوسایتومتری برای شناسایی سلول‌های NP استفاده نمود. همچنین داربست آلژینات نسبت به داربست کیتوسان-ژلاتین محیط مناسب‌تری برای رشد و تکثیر سلول‌های NP انسانی در in vitro فراهم می‌کند. پیشنهاد می‌شود از این داربست برای کشت سلول‌های NP در in vivo استفاده گردد. واژگان کلیدی: دیسک بین مهره‌ای، مهندسی بافت، کیتوسان، ژلاتین، آلژینات، سیتوکراتین 18
عنوان مقاله [English]
Recognition of Cytokeratin 18 Marker by Flow Cytometry of Nucleus Pulposus Cells in Human Intervertebral Disc and Comparison of Proliferation and Morphology of these Cells in Chitosan-Gelatin and Alginate Scaffolds
نویسندگان [English]
-
Masoud Ghorbani
1
-
Batool Hashemibani
2
-
Hamid Bahramian
2
-
Zeinab Karimi
3
-
Saeed Zamani
4
-
Seyyed Ahmad Mirhosseini
5
-
Seyyed Hamid Zarkesh Isfahani
6
1
PhD Student, Department of Tissue Engineering, School of Modern Technologies, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
2
Assistant Professor, Department of Anatomy and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3
Student of Medicine, School of Medicine And Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4
PhD Student, Department of Anatomy and Molecular Biology, School of Medicine And Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
5
Professor, Department of Neurosurgery, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
6
Associate Professor, Department of Immunology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Background: Low back pain is a major economical and social problem nowadays. Intervertebral disc herniation and central degeneration of disc are two major reasons of low back pain that occur because of structural impairment of discs. Intervertebral disc includes the annulus fibrosus, transitional region, and nucleus pulposus (NP). NP forms the central nucleus of the disc. Reduction of cell count and extracellular matrix, especially in NP, causes disc degeneration. Different scaffolds (natural and synthetic) have been used for tissue repairing and regeneration of intervertebral disc in tissue engineering. Most scaffolds have biodegradable and biocompatible characteristics and also prepare a fine condition for proliferation and migration of cells. Although no specific marker or method has been suggested for recognition of NP cells, some studies have used real time and immunocytochemical methods and reported high expression of cytokeratin 19, 18, 8, and others as markers for NP cells. This study aimed to recognize NP cells of human intervertebral disc by flow cytometry of cytokeratin 18 marker. It also compared the proliferation and morphology of these cells in chitosan-gelatin scaffold and alginate scaffold. Methods: NP cells were derived by enzymatic hydrolysis of collagenase from NP tissue of patients undergoing open surgery for discectomy in Alzahra Hospital (Isfahan, Iran). Chitosan was blended with gelatin and glutaraldehyde was used for cross linking of the two polymers. Then, alginate scaffold was prepared. After approving the NP cells by flow cytometry of cytokeratin 18 marker, a cellular suspension with 4×105 cells was transferred to each scaffold and cultured for 21 days. Cell viability and proliferation were investigated by trypan blue and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. A scanning electron microscope (SEM) was used to assert the porosity and to survey the structures of the scaffolds. Findings: We can use flow cytometry of cytokeratin 18 markers for recognition of NP cells. MTT assay demonstrated that cell viability on the third day had significant difference with the first day in both scaffolds. There was also a significant reduction in cellular viability from day 3 to day 21. Results of cell count showed that mean difference between cell counts in alginate scaffold was significantly more than chitosan-gelatin scaffold (P < 0.001). Conclusion: Flow cytometry of cytokeratin 18 can be used as a method for recognition of NP cells. Compared to chitosan-gelatin scaffold, alginate scaffold prepared a better condition for proliferation of NP cells. The results of this study suggested that alginate scaffold could be useful in in-vivo studies and treatment. Keywords: Intervertebral disc, Tissue engineering, Degeneration, Scaffold, Chitosan, Gelatin, Alginate, Cytokeratin 18
)