نوع مقاله : مقاله های پژوهشی
نویسندگان
1
استاد، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
2
استاد، گروه فارماکولوژی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
3
دانشجوی دکترای داروسازی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
4
کارشناس ارشد، گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده‌ی داروسازی و علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
مقدمه: آنزیم Taq پلیمراز به صورت گسترده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction یا PCR) کاربرد دارد. یکی از قسمت‌های مهم دخیل در فعالیت این آنزیم، منطقه‌ی O-helix آنزیم می‌باشد. طی تحقیقات قبلی یک وکتور بیانی شامل موتاسیون Asn-666-Glu بر روی ژن آنزیم طراحی شده است. به منظور بررسی تأثیر این موتاسیون بر روی فعالیت آنزیم در ابتدا باید به خالص‌سازی آنزیم Taq پلیمراز پرداخت. هدف از این پروژه، جداسازی و خالص‌سازی آنزیم Taq پلیمراز نوترکیب از گونه‌ی باکتری اشرشیاکلی Bl21 بود. روش‌ها: در این مطالعه پس از ترانسفورم کردن سلول‌های پذیرا با پلاسمید حاوی ژن Taq پلیمراز موتانت شده در ناحیه‌ی N666E و القای بیان آنزیم با ایزوپروپیل بتا تیوگالاکتوزید (Isopropyl β-D thiogalactopyranoside یا IPTG) از روش‌های خالص‌سازی Desai، پروتکل Desai بهینه‌سازی شده، رزین- نیکل (Ni-NTA His.Bind Resins)، تری کلرو استیک اسید (Trichloroacetic acid یا TCA) و رفولدینگ (Refolding) به منظور تخلیص آنزیم Taq پلیمراز استفاده گردید و در نهایت به مقایسه‌ی این روش‌ها با یکدیگر پرداخته شد. یافته‌ها: در مقایسه‌ی نتایج با یکدیگر، استفاده از پروتکل Desai علاوه بر این که باندی شارپ در ناحیه‌ی مورد انتظار (94 کیلودالتون) ایجاد نمود، در سایر نواحی نیز باندهایی دیده شد؛ اما پس از بهینه‌سازی پروتکل Desai تنها باند مورد نظر قابل مشاهده بود. با استفاده از تری کلرو استیک اسید و رزین- نیکل باندهای دیده شده در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون ضعیف بود و گاهی باندهای دیگری در سایر نواحی دیده شد. با رفولدینگ آنزیم، باند ایجاد شده در ناحیه‌ی 66 کیلودالتون مشاهده شد. نتیجه‌گیری: روش خالص‌سازی Desai که با استفاده از RNase و DNase بهینه‌سازی شده انجام شد، باعث ایجاد باندی واضح و مناسب در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون گردید. استفاده از تری کلرو استیک اسید به منظور رسوب پروتئین‌هایی که با حرارت از بین نرفته‌اند و استفاده از رزین- نیکل باعث حذف تقریبی باندهای ناخواسته شد، هر چند مقدار آنزیم مورد نظر را نیز در ناحیه‌ی 94 کیلودالتون کاهش داد. در مورد باند 66 کیلودالتون ایجاد شده در فرایند رفولدینگ آنزیم، این احتمال وجود دارد که در حین جداسازی اینکلوژن بادی‌ها از سلول، باقی ماندن آنزیم پروتئاز باعث شکست آنزیم در این ناحیه شده باشد. واژگان کلیدی: آنزیم Taq پلیمراز نوترکیب، خالص‌سازی Desai، O-helix mutation
عنوان مقاله [English]
Optimization of the Production and Purification of Taq Polymerase Enzyme Containing N666E Mutation in its O-Helix Region
نویسندگان [English]
-
Hamid Mirmohammad Sadeghi
1
-
Mohammed Rabbani
2
-
Samaneh Assarzadeh
3
-
Fatemeh Moazen
4
1
Professor, Department of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2
Professor, Department of Pharmacology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3
PharmD Candidate, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, And Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4
Department of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Background: The aim of this project was to isolate and purify the highly active recombinant Taq DNA polymerase from the strain of Escherichia coli BL21. This enzyme, with a molecular weight of about 94 kDa, is widely used in polymerase chain reaction (PCR). In PCR, the activity and fidelity of Taq polymerase can significantly influence the results. One of the active regions of Taq polymerase has been suggested to be the O-helix region. In previous studies, an expression vector containing mutated Asn 666 Glu Taq polymerase gene was designed. In order to investigate the effects of this mutation on the function of the enzyme, Taq polymerase needs to be purified first. Methods: In this study, after transformation of competent cells, enzyme expression was induced by isopropyl β D thiogalactopyranoside (IPTG) method. Modified Desai protocol with DNase and RNase, nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin, trichloroacetic acid (TCA), and refolding protocols were subsequently used for purification of this enzyme. These protocols were finally compared. Findings: Using Desai protocol resulted in the production of a sharp band in the expected region (94 kDa) and several other visible bands. After further modification of Desai protocol, only the desirable band was observed. In protocols using TCA and Ni-NTA resin, the expected bands were weak. Refolding protocol caused a band in an undesirable region (66 kDa). Conclusion: From the different purification techniques that were used in this study, the modified method of Desai containing RNase and DNase worked best. Addition of TCA can precipitate proteins that had not been affected by heat. Using Ni-NTA resin resulted in elimination of unwanted bands. However, the amount of Taq polymerase was also decreased. The extra band that was observed in refolding protocol was probably due to the presence of proteases that were isolated with inclusion body and could digest Taq polymerase. Keywords: Taq polymerase recombinant, Purification, Desai protocol, O-helix mutation
)