مقایسه‌ی تعداد نسخه‌های درج شده‌ی ژن 10-IP با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی بر اساس سیستم ترانسپوزونی PiggyBac در ژنوم سلول‌های Human embryonic kidney

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی و کمیته‌ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

2 استادیار، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

3 دانشیار، گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

4 دانشیار، مرکز تحقیقات بیماری های ارثی کودکان و گروه ژنتیک و بیولوژی مولکولی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: یکی از چالش‌های پیش رو در روش‌های مرسوم تولید پروتئین نوترکیب که ترانسژن به صورت خطی به سلول میزبان وارد می‌شود، هتروژنی در تعداد نسخه‌‌های ترانسژن در کلون‌های مختلف به دست آمده است که منجر به بیان ژن در سطوح مختلف می‌شود. گذشته از کارایی پایین درج خطی در ژنوم میزبان، پدیده‌ای دیگر به نام Position effect باعث کمتر شدن کارایی بیان ژن می‌گردد. PiggyBac کلاسی از DNA ترانسپوزونی است که می‌تواند به صورت مکانیزم Cut and paste در ژنوم سلول میزبان جابه‌جا شود. برخی خصوصیات منحصر به فرد این ترانسپوزون، آن را به یکی از وکتور‌های مناسب در مطالعات انتقال ژن تبدیل کرده است. انتقال ترانسژن با حجم بالا و درج در نواحی فعال از نظر رونویسی، از جمله خصوصیات مهم این ترانسپوزون است که می‌توان از آن در تولید پروتئین نوترکیب با کارایی بالا بهره برد. در این تحقیق، تعداد نسخه‌‌های درجی در کلون‌های به دست آمده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی این سیستم در رده‌ی سلولی HEK (Human embryonic kidney) مقایسه شده است.روش‌ها: تولید سازه‌‌های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی سیستم ترانسپوزاز حاوی ژن 10-IP و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین با استفاده از روش‌های کلونینگ مولکولی به انجام رسید. رده‌ی سلولی HEK پس از تکثیر در پلیت‌های سلولی جهت انجام ترانسفکشن Seed شدند. سازه‌‌ها با استفاده از کیت لیپوفکتامین 2000 ترانسفکت شدند و پس از 48 ساعت مورد تیمار با آنتی بیوتیک هیگرومایسین به مدت دو هفته قرار گرفتند. کلون‌های به دست آمده پس از استخراج DNA ژنومی با تکنیک Absolute real-time PCR (Absolute real-time polymerase chain reaction) از نظر تعداد نسخه‌‌های ژنی درج شده مورد بررسی قرار گرفتند.یافته‌ها: تعداد نسخه‌‌های ژنی به دست آمده با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی در هر سلول، برابر با 5 نسخه بود؛ در حالی که این عدد در سیستم دو پلاسمیدی برابر با دو نسخه بود.نتیجه‌گیری: بررسی نتایج حاصل از تعداد نسخه‌‌های درجی در سیتم‌‌های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی نشان داد که سیستم تک پلاسمیدی کارایی بالاتری از لحاظ تعداد نسخه‌‌های درجی دارد و می‌توان با کلون کردن ژن مورد نظر و کاست بیان کننده‌ی آنزیم ترانسپوزاز در یک پلاسمید واحد، تعداد نسخ بیشتری جهت بیان بیشتر پروتئین نوترکیب به دست آورد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Comparison of Inserted Mouse IP-10 Gene Copy Number in Helper-Dependent and Independent System Based on PiggyBac Transposition in Human Embryonic Kidney Cells

نویسندگان [English]

  • Hadi Mirzapour 1
  • Arezo Karamzade 1
  • Hossein Khanahmad 2
  • Rasoul Salehi 3
  • Majid Kheirollahi 4
1 MSc Student, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine AND Student Research Committee, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Assistant Professor, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Associate Professor, Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
4 Associate Professor, Pediatric Inherited Diseases Research Center AND Department of Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Background: A major bottleneck in the production of recombinant proteins in conventional linear method is the heterogeneity in number of transgene copies in the genome of the host cell that lead to variable levels of transgene expression. Aside from the low efficiency of the random integration, other phenomena such as positional effect contribute to low efficiency of transgene expression. PiggyBac is a class of DNA transposons which can transpose through “cut and paste” mechanism in host genome. Some specific characteristic of this transposon makes it promise vector in gene transfer studies. High capacity of transgene transposition and flexibility in molecular engineering of transposase are characteristics of PiggyBac transposons that are important in recombinant protein and gene therapy approaches. The aim of this study was estimation of transgene copy number based on helper-dependent and independent PiggyBac transposition system in human embryonic kidney (HEK) cells.Methods: Plasmid containing interferon gamma inducible protein 10 (IP-10) coding sequence flanked by PiggyBac terminal repeat element and plasmid containing transposase system and a unit plasmid containing both transposae and IP-10 coding sequence were used for generating recombinant cells in helper-dependent and independent system, respectively. Human embryonic kidney cells were transfected by each group. After clonal selection, absolute quantitative real-time polymerase chain reaction was used for estimation of transgene copy number.Findings: Estimation of IP-10 copy number has revealed 5 and 2 copies per cell in helper-independent and dependent system, respectively.Conclusion: Here, we report activity of PiggyBac transposition in human embryonic kidney cell line. PiggyBac helper-independent and dependent system was used for generation of stable cell line producing mouse IP-10 protein and our data confirmed permanent expression of this transgene with the mean of about 5 transgene copies per each cell.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Piggybac transposon
  • Gene therapy
  • Recombinant protein
  • Transgene copy number

مراجع

  1. Gorman C, Bullock C. Site-specific gene targeting for gene expression in eukaryotes. Curr Opin Biotechnol 2000; 11(5): 455-60.
  2. Matasci M, Baldi L, Hacker DL, Wurm FM. The PiggyBac transposon enhances the frequency of CHO stable cell line generation and yields recombinant lines with superior productivity and stability. Biotechnol Bioeng 2011; 108(9): 2141-50.
  3. Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol 2007; 25(9): 425-32.
  4. Kwaks TH, Otte AP. Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends Biotechnol 2006; 24(3): 137-42.
  5. Weiler KS, Wakimoto BT. Heterochromatin and gene expression in Drosophila. Annu Rev Genet 1995; 29: 577-605.
  6. Fraser MJ, Ciszczon T, Elick T, Bauser C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol 1996; 5(2): 141-51.
  7. Ding S, Wu X, Li G, Han M, Zhuang Y, Xu T. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell 2005; 122(3): 473-83.
  8. Bauser CA, Elick TA, Fraser MJ. Proteins from nuclear extracts of two lepidopteran cell lines recognize the ends of TTAA-specific transposons piggyBac and tagalong. Insect Mol Biol 1999; 8(2): 223-30.
  9. Galvan DL, Nakazawa Y, Kaja A, Kettlun C, Cooper LJ, Rooney CM, et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother 2009; 32(8): 837-44.
  10. Fraser MJ, Cary L, Boonvisudhi K, Wang HG. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology 1995; 211(2): 397-407.
  11. Matasci M, Bachmann V, Baldi L, Hacker DL, De JM, Wurm FM. CHO cell lines generated by PiggyBac transposition. BMC Proc 2011; 5(Suppl 8): 31.
  12. Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108(4): 1531-6.
  13. Vink CA, Gaspar HB, Gabriel R, Schmidt M, McIvor RS, Thrasher AJ, et al. Sleeping beauty transposition from nonintegrating lentivirus. Mol Ther 2009; 17(7): 1197-204.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 275 - شماره پیاپی 275
فروردین و اردیبهشت 1393
صفحه 170-181

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 06 آبان 1392
  • تاریخ بازنگری: 06 اردیبهشت 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار