تعیین توالی وآنالیز فیلوژنی ژن NS دو جدایه‌ی آنفلوانزای 2N9H و بررسی خصوصیات رشد این ویروس‌ها بر روی سلول‌های 549A

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار، گروه آنفلوانزای طیور، مؤسسه‌ی تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، کرج، ایران

2 کارشناس ارشد، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جهرم، جهرم، ایران

3 دانشجوی دکترای تخصصی، گروه ویروس‌شناسی، دانشکده‌ی بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

4 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه آنفلوانزای طیور، مؤسسه‌ی تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: ویروس‌ آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ 2N9H در طول دو دهه‌ی گذشته در آسیا به صورت پانزوتیک در آمده است. این ویروس، علاوه بر ایجاد بیماری در طیور پرورشی، چندین مورد ابتلای انسانی در آسیا را سبب شده است. این مطالعه به منظور بررسی‌ ارتباط فیلوژنی ژن غیر ساختمانی (NS یا Non structural) و خصوصیات رشدشان بر روی سلول‌های 549A در جدایه‌هایی در استان تهران انجام شد.روش‌ها: از میان ویروس‌های ایزوله شده در سال‌های 91-1388 ویروس آنفلوانزای 2N9H، دو ویروس که در درخت فیلوژنتیک جایگاه‌های متفاوتی با هم داشتند، انتخاب شدند و ژن NS طی واکنش RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) تکثیر شد. قطعه‌ی مورد نظر هر جدایه، کلون گردید و پلاسمیدهای حاصل توالی‌یابی شدند. بروز تغییرات احتمالی در توالی‌ ژن NS جدایه‌های مورد نظر با مقایسه با جدایه‌های ثبت شده در پایگاه داده GenBank ارزیابی شد. بر اساس نتایج، رشد این دو جدایه در سلول‌های 549A بررسی شد. ارزش s3GC و مقایسه‌ی میزان جایگزینی Ka/Ks در نواحی رمز دهنده‌ی ژن بررسی شد.یافته‌ها: پردازش اولیه‌ی داده‌های فیلوژنی نشان داد که ژن NS ویروس‌‌های ایران با همسانی 4/96 درصد به زیر دودمان 439Y و آلل A تعلق دارند. این ویروس‌ها بر اساس زمان جداسازی در دو زیر گروه زیر گروه یک شامل ویروس‌های جدا شده از طیور پرورشی طی سال‌های 2004-1998 و زیر گروه دوم ویروس‌های جدا شده طی سال‌های 11-2006 قرار گرفتند. ارزش s3GC بین 392/0-371/0 متغیر بود و میزان Ka/Ks برای زیر گروه اول 38/0 و برای زیر گروه دوم 42/0 محاسبه شد.نتیجه‌گیری: پردازش توالی اسید آمینه‌ی NS نشان می‌دهد که این دو ایزوله، دارای توالی KSLR در محل دمین PDZ خود هستند و چندین تغییر همزمان در طول توالی اسید آمینه رخ داده ‌است. عیار دو ویروس به روش ارزیابی پلاک برآورد شد که تفاوت معنی‌داری با هم نداشتند. این داده‌ها نشان می‌دهد که دو ویروس 2N9H جدید ایران دچار تغییرات بسیار اندکی شده‌اند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Sequencing and Phylogenetic Analysis of NS Gene of Two Isolates of H9N2 Influenza Virus and The Growth Characteristics of the Virus on A549 Cells

نویسندگان [English]

  • Shahla Shahsavandi 1
  • Abbas Ahmadi-Vasmehjani 2
  • Mohammad Shayestehpour 3
  • Kaweh Sadeghi 4
  • Mohammad Majid Ebrahimi 1
  • Hadi Fazel 3
1 Assistant Professor, Department of Avian Influenza, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Iran
2 MSc Student, Department of Microbiology, School of Medicine, Jahrom University of Medical Sciences, Jahrom, Iran
3 PhD Student, Department of Virology, School of Public Health ,Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4 Department of Avian Influenza, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Iran
چکیده [English]

Background: Avian influenza virus of H9N2 subtype has become panzootic during the last two decades in Asia. In addition to causing disease in poultry, this virus has been identified as the reason for several human diseases in Asia. The present study aimed to investigate the phylogenetic relationship between NS gene of two viruses (SS2\2008 and SS8\2011) and other Iranian isolated viruses, and we characterized the growth ability of two viruses in human A549 cell.Methods: Among the H9N2 viruses isolated from 2008 to 2011, two isolated were placed in different positions in the phylogenetic tree. The whole NS gene fragments of two virus isolates were amplified using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method; the fragment of each isolate was cloned and then sequenced. Possible changes in the NS gene sequence of isolates were compared with subtypes registered in Gene Bank Database and their growth abilities in human A549 cells were evaluated. GC3s value and replacement rate of Ka/Ks value in NS gene locus were compared.Findings: The initial phylogenetic process revealed that the NS gene of Iranian isolates had a homology of 96.4% belonging to clade Y439 and Allele A. These viruses, based on the time of isolation, were divided into two subgroups of viruses isolated from poultry during the years 1998-2004 and viruses isolated during a time curse of the years 2006-2011. GC3s value varied between 0.371-0.392 and the Ka/Ks value NS gene locus was 0.38 and 0.42 in subgroups 1 and 2, respectively.Conclusion: Processing of NS amino acid sequence not only exhibited that these two isolates contained KSLR sequence in their PDZ domain and but also it revealed that multiple simultaneous changes had been occurred. The viruses titers of two isolates, based on plaque assay, were not statistically significant. These data demonstrate that two Iranian H9N2 isolates are affected by some genetic drifts.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Avian influenza
  • H9N2 Subtype
  • PDZ domain

مراجع

  1. Wright PF, Webster RG. Orthomyxoviruses. In: Knipe DM, Howley PM, editors. Fields virology. 4th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins; 2001. p. 1533-79.
  2. Skehel JJ, Waterfield MD. Studies on the primary structure of the influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72(1): 93–7.
  3. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev 1992; 56(1): 152-79.
  4. A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO memorandum. Bull World Health Organ 1980; 58(4): 585-91.
  5. Shortridge KF. Pandemic influenza: a zoonosis? Semin Respir Infect 1992; 7(1): 11-25.
  6. Cameron KR, Gregory V, Banks J, Brown IH, Alexander DJ, Hay AJ, et al. H9N2 subtype influenza A viruses in poultry in pakistan are closely related to the H9N2 viruses responsible for human infection in Hong Kong. Virology 2000; 278(1): 36-41.
  7. Butt KM, Smith GJ, Chen H, Zhang LJ, Leung YH, Xu KM, et al. Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003. J Clin Microbiol 2005; 43(11): 5760-7.
  8. Wang W, Riedel K, Lynch P, Chien CY, Montelione GT, Krug RM. RNA binding by the novel helical domain of the influenza virus NS1 protein requires its dimer structure and a small number of specific basic amino acids. RNA 1999; 5(2): 195-205.
  9. Nemeroff ME, Qian XY, Krug RM. The influenza virus NS1 protein forms multimers in vitro and in vivo. Virology 1995; 212(2): 422-8.
  10. Ludwig S, Wang X, Ehrhardt C, Zheng H, Donelan N, Planz O, et al. The influenza A virus NS1 protein inhibits activation of Jun N-terminal kinase and AP-1 transcription factors. J Virol 2002; 76(21): 11166-71.
  11. Ludwig S, Schultz U, Mandler J, Fitch WM, Scholtissek C. Phylogenetic relationship of the nonstructural (NS) genes of influenza A viruses. Virology 1991; 183(2): 566-77.
  12. Treanor JJ, Snyder MH, London WT, Murphy BR. The B allele of the NS gene of avian influenza viruses, but not the A allele, attenuates a human influenza A virus for squirrel monkeys. Virology 1989; 171(1): 1-9.
  13. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24(8): 1596-9.
  14. Shapiro GI, Krug RM. Influenza virus RNA replication in vitro: synthesis of viral template RNAs and virion RNAs in the absence of an added primer. J Virol 1988; 62(7): 2285-90.
  15. Choi YK, Ozaki H, Webby RJ, Webster RG, Peiris JS, Poon L, et al. Continuing evolution of H9N2 influenza viruses in Southeastern China. J Virol 2004; 78(16): 8609-14.
  16. Kwon JS, Lee HJ, Lee DH, Lee YJ, Mo IP, Nahm SS, et al. Immune responses and pathogenesis in immunocompromised chickens in response to infection with the H9N2 low pathogenic avian influenza virus. Virus Res 2008; 133(2): 187-94.
  17. Monne I, Ormelli S, Salviato A, De BC, Bettini F, Salomoni A, et al. Development and validation of a one-step real-time PCR assay for simultaneous detection of subtype H5, H7, and H9 avian influenza viruses. J Clin Microbiol 2008; 46(5): 1769-73.
  18. Das A, Suarez DL. Development and bench validation of real-time reverse transcription polymerase chain reaction protocols for rapid detection of the subtypes H6, H9, and H11 of avian influenza viruses in experimental samples. J Vet Diagn Invest 2007; 19(6): 625-34.
  19. Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Hoper D, Beer M. Design and validation of a microarray for detection, hemagglutinin subtyping, and pathotyping of avian influenza viruses. J Clin Microbiol 2009; 47(2): 327-34.
  20. Nili H, Asasi K. Natural cases and an experimental study of H9N2 avian influenza in commercial broiler chickens of Iran. Avian Pathol 2002; 31(3): 247-52.
  21. Nili H, Asasi K. Avian influenza (H9N2) outbreak in Iran. Avian Dis 2003; 47(3 Suppl): 828-31.
  22. Iqbal M, Yaqub T, Reddy K, McCauley JW. Novel genotypes of H9N2 influenza A viruses isolated from poultry in Pakistan containing NS genes similar to highly pathogenic H7N3 and H5N1 viruses. PLoS One 2009; 4(6): e5788.
  23. Bi J, Deng G, Dong J, Kong F, Li X, Xu Q, et al. Phylogenetic and molecular characterization of H9N2 influenza isolates from chickens in Northern China from 2007-2009. PLoS One 2010; 5(9).
  24. Butt AM, Siddique S, Idrees M, Tong Y. Avian influenza A (H9N2): computational molecular analysis and phylogenetic characterization of viral surface proteins isolated between 1997 and 2009 from the human population. Virol J 2010; 7: 319.
  25. Fazel H, Shahsavandi S, Masoudi S, Ebrahimi M, Taghizadeh M. Evolutionary characterization of non-structural gene of H9N2 influenza viruses isolated from Asia during 2008-2012. Comp Clin Pathol 2014; 23(3): 523-8.
  26. Matrosovich MN, Krauss S, Webster RG. H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity. Virology 2001; 281(2): 156-62.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 280 - شماره پیاپی 280
خرداد و تیر 1393
صفحه 432-441

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 01 دی 1392
  • تاریخ بازنگری: 01 اردیبهشت 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار