تولید پروکاریوتی پروتئین 2M ویروس آنفلوانزا در اتصال با پروتئین شوک حرارتی لیشمانیا ماژور به منظور دستیابی به یک واکسن کارآمد

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، قم، ایران

2 استادیار، گروه ویروس‌شناسی، آزمایشگاه تحقیقات آنفلوانزا، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

3 استادیار، گروه ویروس‌شناسی پزشکی و ایمنی‌شناسی، دانشکده‌ی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران

4 کارشناس ارشد، گروه ویروس‌شناسی، آزمایشگاه تحقیقات آنفلوانزا، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

5 کارشناس آزمایشگاه، گروه ویروس‌شناسی، آزمایشگاه تحقیقات آنفلوانزا، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: ویروس‌های آنفلوانزا عامل عمده‌ی بیماری و مرگ و میر ناشی از بیماری‌های تنفسی در جهان به شمار می‌روند و واکسیناسیون، بهترین راه پیشگیری می‌باشد. به علت تغییرات آنتی ژنیک ویروس آنفلوانزا، بازآرایی هر ساله‌ی واکسن اجتناب ناپذیر است. یکی از روش‌های مقابله با این مشکل، طراحی واکسن با استفاده از آنتی ژن‌های حفاظت شده‌ی ویروس آنفلوانزا است. پروتئین 2M که در پوشش ویروس، کانال یونی را تشکیل می‌دهد و با تغییرات pH باعث ورود ویروس و ایجاد عفونت در سلول‌های میزبان می‌شود، در بین همه‌ی ویروس‌های آنفلوانزای A حفاظت شده است و هدف مناسبی برای تولید واکسن با ایمنی وسیع‌الطیف می‌باشد. در این مطالعه، به منظور تولید یک واکسن کارآمد، بخشی از ژن 70HSP (70Heat shock proteins) لیشمانیا ماژور به ژن 2M ویروس آنفولانزای 1N1H/A متصل شد و پروتئین نوترکیب کایمر در سیستم پروکاریوتی بیان گردید.روش‌ها: برای ساخت سازه‌ی بیانی، ابتدا ژن کد کننده‌ی HSP در پلاسمید a28pET در بین محل اثر آنزیم‌های BamHI و HindIII جای‌سازی گردید. سپس ژن 2M به روش PCR (Polymerase chain reaction) و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، تکثیر یافت و در محل اثر سایت آنزیمی BamHI در وکتور خطی و دفسفریله شده‌ی a28pET و در بالادست ژن 70HSP کلون گردید. پس از تعیین ترادف و تأیید صحت کلونینگ، بیان پروتئین نوترکیب در سلول‌های 21BL مورد بررسی قرار گرفت.یافته‌ها: نتایج کلنی PCR و هضم آنزیمی، صحت سازه‌های نوترکیب را تأیید کردند. نتایج تعیین توالی نشان داد که ژن 2Mدر وکتور a28pET و در بالادست ژن 70HSP به طور صحیح و در قاب خواندنی دنباله‌ی هیستیدینی کلون شده است. تولید پروتئین‌های نوترکیب به روش وسترن بلات (Western blot) تأیید گردید.نتیجه‌گیری: پروتئین‌های شوک حرارتی توانایی تحریک و ایجاد هر دو نوع ایمنی ذاتی و اکتسابی را دارند و اتصال آن به آنتی ژن هدف باعث افزایش پاسخ‌های ایمنی می‌شود. پروتئین کایمر تهیه شده در این مطالعه، پس از تخلیص می‌تواند به عنوان یک کاندیدای واکسن زیر واحدی مناسب برای پیشگیری از عفونت آنفلوانزا در نظر گرفته شود. برای بررسی اثرات ادجوانتی 70HSP لیشمانیا ماژور بر روی پروتئین 2M، ارزیابی ایمونوژنیسیتی آن در مدل‌های حیوانی در مطالعات آتی انجام خواهد شد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Prokaryotic Production of Influenza Virus M2 Protein Fused to Leishmania Major HSP70 in Order to Prepare an Effective Flu Vaccine

نویسندگان [English]

  • Siavash Chalabiani 1
  • Fatemeh Fotouhi 2
  • Amir Ghaemi 3
  • Maryam Saleh 4
  • Behrokh Farahmand 2
  • Mohammad Ali Alavi-Esfahani 1
  • Mansoureh Tabatabaian 5
  • Ali Torabi 5
1 Department of Microbiology, School of Biological Science, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran
2 Assistant Professor, Department of Virology, Influenza Research Lab, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Assistant Professor, Department of Medical Virology and Immunology, School of Medicine, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran
4 Department of Virology, Influenza Research Lab, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
5 Lab Instructor, Influenza Research Lab, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Influenza is a major cause of morbidity and mortality in the world. Permanent antigenic variation of influenza virus A causes a major concern to develop influenza vaccine. Now, some researchers are focusing on conserved antigens. The M2 protein is a proton-selective ion channel, integral in the viral envelope of the influenza virus A and allows the virus to enter and cause an infection in the host cells. This protein is conserved among all types of influenza virus A and an appropriate target for the development of influenza vaccine with broad-spectrum protection. In this study, Leishmania major heat shock protein-70 fused to M2 protein to prepare an effective vaccine against influenza virus A.Methods: Lm. HSP70 gene was cloned into BamHI and HindIII sites of pET28a vector. Influenza virus M2 gene was amplified via polymerase chain reaction (PCR) using specific primers and cloned into dephosphorylated linear pET28a vector upstream of Leishmania major HSP70 gene. The confirmed construct was transformed into Escherichia coli BL21 and protein expression was induced using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).Findings: The recombinant plasmids were confirmed via colony PCR, restriction enzyme analysis and sequencing. The result of sequencing revealed that the M2 gene was properly cloned into pET28a-HSP70 in the right frame to 6xhis tag. The protein expression was determined using Western blot analysis.Conclusion: Binding of HSP to the desired antigen induces increased level of immune responses. Hence, the chimer protein prepared in this study, could be an appropriate vaccine candidate to prevent influenza infection. The immunogenicity of this chimer protein with different formulation is going to evaluate in animal models. To investigate the effect of HSP on M2 immunogenicity, this chimer protein will be evaluated in future projects.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Influenza virus A
  • Chimer protein
  • M2
  • HSP70

مراجع

  1. Rothberg MB, Haessler SD, Brown RB. Complications of viral influenza. Am J Med 2008; 121(4): 258-64.
  2. Nelson MI, Holmes EC. The evolution of epidemic influenza. Nat Rev Genet 2007; 8(3): 196-205.
  3. Zimmer G. RNA replicons - a new approach for influenza virus immunoprophylaxis. Viruses 2010; 2(2): 413-34.
  4. Cox RJ, Brokstad KA, Ogra P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand J Immunol 2004; 59(1): 1-15.
  5. Gerdil C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine 2003; 21(16): 1776-9.
  6. Lamb RA, Lai CJ, Choppin PW. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 1981; 78(7): 4170-4.
  7. Wu F, Huang JH, Yuan XY, Huang WS, Chen YH. Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus. Vaccine 2007; 25(52): 8868-73.
  8. Zebedee SL, Lamb RA. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol 1988; 62(8): 2762-72.
  9. Treanor JJ, Tierney EL, Zebedee SL, Lamb RA, Murphy BR. Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J Virol 1990; 64(3): 1375-7.
  10. Torok Z, Tsvetkova NM, Balogh G, Horvath I, Nagy E, Penzes Z, et al. Heat shock protein coinducers with no effect on protein denaturation specifically modulate the membrane lipid phase. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(6): 3131-6.
  11. Tamura Y, Saito K, Sato N. Heat shock protein inhibitor for molecular targeting therapy. Nihon Rinsho 2012; 70(Suppl 8): 135-9. (In Japanese).
  12. Rafati S, Gholami E, Hassani N, Ghaemimanesh F, Taslimi Y, Taheri T, et al. Leishmania major heat shock protein 70 (HSP70) is not protective in murine models of cutaneous leishmaniasis and stimulates strong humoral responses in cutaneous and visceral leishmaniasis patients. Vaccine 2007; 25(21): 4159-69.
  13. Esghaei M, Monavari SH, Tavassoti-Kheiri M, Shamsi-Shahrabadi M, Heydarchi B, Farahmand B, et al. Expression of the influenza M2 protein in three different eukaryotic cell lines. J Virol Methods 2012; 179(1): 161-5.
  14. Alavi-Esfahani MA, Fotouhi-Chahooki F, Saleh M, Tavakoli R, Farahmand B, Ghaemi A, et al. Over expression of influenza virus M2 protein in prokaryotic system. Iran J Virol 2012; 6(4): 13-9
  15. Fu TM, Freed DC, Horton MS, Fan J, Citron MP, Joyce JG, et al. Characterizations of four monoclonal antibodies against M2 protein ectodomain of influenza A virus. Virology 2009; 385(1): 218-26.
  16. Slepushkin VA, Katz JM, Black RA, Gamble WC, Rota PA, Cox NJ. Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine 1995; 13(15): 1399-402.
  17. Okuda K, Ihata A, Watabe S, Okada E, Yamakawa T, Hamajima K, et al. Protective immunity against influenza A virus induced by immunization with DNA plasmid containing influenza M gene. Vaccine 2001; 19(27): 3681-91.
  18. Zhao G, Du L, Xiao W, Sun S, Lin Y, Chen M, et al. Induction of protection against divergent H5N1 influenza viruses using a recombinant fusion protein linking influenza M2e to Onchocerca volvulus activation associated protein-1 (ASP-1) adjuvant. Vaccine 2010; 28(44): 7233-40.
  19. Chen W, Lin Y, Liao C, Hsieh S. Modulatory effects of the human heat shock protein 70 on DNA vaccination. J Biomed Sci 2000; 7(5): 412-9.
  20. Li J, Li KN, Gao J, Cui JH, Liu YF, Yang SJ. Heat shock protein 70 fused to or complexed with hantavirus nucleocapsid protein significantly enhances specific humoral and cellular immune responses in C57BL/6 mice. Vaccine 2008; 26(25): 3175-87.
  21. Ebrahimi SM, Tebianian M, Toghyani H, Memarnejadian A, Attaran HR. Cloning, expression and purification of the influenza A (H9N2) virus M2e antigen and truncated Mycobacterium tuberculosis HSP70 as a fusion protein in Pichia pastoris. Protein Expr Purif 2010; 70(1): 7-12.
  22. Ebrahimi SM, Tebianian M. Heterologous expression, purification and characterization of the influenza A virus M2e gene fused to Mycobacterium tuberculosis HSP70(359-610) in prokaryotic system as a fusion protein. Mol Biol Rep 2010; 37(6): 2877-83.
  23. Shaw A. Conserved proteins as potential universal vaccines. In: Rappuoli R, Giudice GD, editors. Influenza vaccines for the future. New York, NY: Springer; 2011. p. 313-25.
  24. Francis DM, Page R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci 2010; Chapter 5: Unit 5.24.1-29.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 32، شماره 288 - شماره پیاپی 288
مرداد و شهریور 1393
صفحه 841-853

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 16 اردیبهشت 1393
  • تاریخ بازنگری: 01 اردیبهشت 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار