تکثیر و توالی‌یابی بخشی از ژن مسؤول تشکیل خط سفید دفاعی در Pseudomonas aeruginosa با استفاده از Degenerate Polymerase Chain Reaction

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی و نانوفن‌آوری پزشکی، دانشکده‌ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، زنجان، ایران

2 استادیار، گروه بیوتکنولوژی و نانوفن‌آوری پزشکی، دانشکده‌ی پزشکی و مرکز تحقیقات زیست فن‌آوری دارویی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، زنجان، ایران

چکیده

مقدمه: لیپوپپتیدهای Pseudomonas مانند White line-inducing principle (WLIP)، دارای فعالیت‌های ضد میکروبی حایز اهمیتی می‌باشند. زمانی که باکتری مولد WLIP در مجاورت با Pseudomonas tolaasii کشت داده شود، خط سفید رنگی در بین آن‌ها ایجاد خواهد شد. با شناسایی راهبرد White line reaction (WLR) و بررسی تنوعات آن در انواع مختلف Pseudomonas شاید بتوان از آن به عنوان رویکردی برای درمان بیماری‌های عفونی استفاده کرد. در این مطالعه، با استفاده از تکنیک Degenerated polymerase chain reaction (Degenerate PCR) سعی گردید تا برای اولین بار به طور جزیی سیستم ژنتیک WLR در Pseudomonas aeruginosa شناسایی شود.روش‌ها: آنالیز دمین آنزیم‌های Non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) با استفاده از ابزار Nonribosomal peptide synthetase-Polyketide synthases (NRPS-PKS) انجام شد. همچنین، با به کارگیری برنامه‌ی Geneious الاینمنت چندگانه‌ی توالی DNA، آنالیزهای فیلوژنتیک و بلاست لوکال انجام گردید. در نهایت، DNA ژنومی Pseudomonas aeruginosa LMG 1272 استخراج و Degenerate PCR انجام شد.یافته‌ها: در ابتدا تکثیر (PCR) بر اساس دمین‌های C1 و TE انجام شد. با وجود تکرارها و تغییرات متعدد، علاوه بر باند مورد نظر، باندهای دیگری نیز به دست آمد. بدین منظور، با استفاده از ژن wlp/wip بلاست بر علیه ژنوم‌های Pseudomonas aeruginosa انجام شد. دو رکورد در دو سویه‌ی Pseudomonas aeruginosa در حدود 50 درصد Identity با ژن wlpB سویه‌ی RW10S2 مشاهده شد. بعد از الاینمنت این دو رکورد با wlpB در RW10S2، طراحی پرایمر و تکثیر انجام شد. با انجام Blastp تنها یک پروتئین به نام Gramicidin D در باکتری Ralstonia solanacearum SD54 با میزان Identity حدود 43 درصد مشاهده شد.نتیجه‌گیری: تشکیل خط سفید دفاعی توسط سویه‌ی Pseudomonas aeruginosa به احتمال زیاد توسط یک سیستم ژنتیک متفاوت از آنچه که تاکنون گزارش شده است، انجام می‌شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Partial Amplification and Sequencing of Gene Involved in Formation of Defensive White Line Reaction in Pseudomonas aeruginosa Using Degenerate Polymerase Chain Reaction

نویسندگان [English]

  • Mahya Sadat Lajevardi 1
  • Azam Ghotbi 1
  • Fatemeh Mousavi 1
  • Hassan Rokni-Zadeh 2
1 MSc Student, Department of Medical Biotechnology and Nanotechnology, School of Medicine, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
2 Assistant Professor, Department of Medical Biotechnology and Nanotechnology, School of Medicine, AND Zanjan Pharmaceutical Biotechnology Research Center, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
چکیده [English]

Background: Pseudomonas lipopeptides such as white line-inducing principle (WLIP) have important antimicrobial activities. When a WLIP producer bacterium is grown close to P. tolaasii, a white line precipitate will be formed between them Identification of white line reaction (WLR) defense strategy and its distribution among different pseudomonads might help to use such an approach for the treatment of infectious diseases  In current study, through a degenerate polymerase chain reaction (PCR) method, the partial characterization of genetic system of NRPS-based WLR was attempted in Pseudomonas aeruginosa for the first time in the world.Methods: Domain analysis of non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) enzymes was performed by the nonribosomal peptide synthetase-Polyketide synthases (NRPS-PKS) tool. Multiple DNA sequence alignments, phylogenetic analyses and local Blast searches were performed by Geneious Pro. The gDNA was extracted from P. aeruginosa LMG 1272 and degenerate PCR was carried out.Findings: First, PCR amplification based on the C1 and TE domains was performed. Despite trying several modifications, a number of bands were obtained in addition to our expected band. For this purpose, the gene wlp/wip blast against Pseudomonas aeruginosa genomes was performed. Two homologes with about 50% identity to wlpB in RW10S2 were obtained. New primers were designed by which the target fragment could be amplified whose Blastp identified only one protein in bacterium Ralstonia solanacearum SD54 with the identity of about 43%.Conclusion: This study shows that the defensive white line formation by P. aeruginosa is governed most likely by a genetic system different from what has been reported before.

کلیدواژه‌ها [English]

  • White line-inducing principle (WLIP) Lipopeptide
  • White line reaction (WLR)
  • Pseudomonads

مراجع

  1. Reardon S. WHO warns against 'post-antibiotic' era. Nature [Online]. [cited 2014 Apr 30]; Available from: URL: http://www.nature.com/news/who-warns-against-post-antibiotic-era-1.15135.
  2. Gross H, Loper JE. Genomics of secondary metabolite production by Pseudomonas spp. Nat Prod Rep 2009; 26(11): 1408-46.
  3. Raaijmakers JM, de Bruijn I, Nybroe O, Ongena M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev 2010; 34(6): 1037-62.
  4. Li W, Rokni-Zadeh H, de Vleeschouwer M, Ghequire MG, Sinnaeve D, Xie GL, et al. The antimicrobial compound xantholysin defines a new group of Pseudomonas cyclic lipopeptides. PLoS One 2013; 8(5): e62946.
  5. Rottig M, Medema MH, Blin K, Weber T, Rausch C, Kohlbacher O. NRPSpredictor2--a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity. Nucleic Acids Res 2011; 39(Web Server issue): W362-W367.
  6. Wong WC, Preece TF. Identification of Pseudomonas tolaasi: the white line in agar and mushroom tissue block rapid pitting tests. J Appl Bacteriol 1979; 47(3): 401-7.
  7. Rokni-Zadeh H, Li W, Sanchez-Rodriguez A, Sinnaeve D, Rozenski J, Martins JC, et al. Genetic and functional characterization of cyclic lipopeptide white-line-inducing principle (WLIP) production by rice rhizosphere isolate Pseudomonas putida RW10S2. Appl Environ Microbiol 2012; 78(14): 4826-34.
  8. Ghequire MG, Rokni-Zadeh H, Zarrineh P, de Mot R. Draft genome sequence of pseudomonas fluorescens LMG 5329, a white line-inducing principle-producing bioindicator for the mushroom pathogen Pseudomonas tolaasii. Genome Announc 2013; 1(4): e00383-13.
  9. Rokni-Zadeh H, Li W, Yilma E, Sanchez-Rodriguez A, de Mot R. Distinct lipopeptide production systems for WLIP (white line-inducing principle) in Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida. Environ Microbiol Rep 2013; 5(1): 160-9.
  10. Munsch P, Alatossava T. The white-line-in-agar test is not specific for the two cultivated mushroom associated pseudomonads, Pseudomonas tolaasii and Pseudomonas "reactans". Microbiol Res 2002; 157(1): 7-11.
  11. Rokni-Zadeh H, Mangas-Losada A, de Mot R. PCR detection of novel non-ribosomal peptide synthetase genes in lipopeptide-producing Pseudomonas. Microb Ecol 2011; 62(4): 941-7.
  12. Andersen OS, Koeppe RE, Roux B. Gramicidin channels. IEEE Trans Nanobioscience 2005; 4(1): 10-20.
  13. Tapi A, Chollet-Imbert M, Scherens B, Jacques P. New approach for the detection of non-ribosomal peptide synthetase genes in Bacillus strains by polymerase chain reaction. Appl Microbiol Biotechnol 2010; 85(5): 1521-31.
  14. Rajendran N. Identification and cloning of a gene locus encoding peptide synthetase of Pseudomonas fluorescens by two sets of PCR primers. Z Naturforsch C 1999; 54(1-2): 105-9.
  15. Ayuso-Sacido A, Genilloud O. New PCR primers for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups. Microb Ecol 2005; 49(1): 10-24.
  16. Palomo S, Gonzalez I, de la Cruz M, Martin J, Tormo JR, Anderson M, et al. Sponge-derived Kocuria and Micrococcus spp. as sources of the new thiazolyl peptide antibiotic kocurin. Mar Drugs 2013; 11(4): 1071-86.
  17. Tambadou F, Lanneluc I, Sable S, Klein GL, Doghri I, Sopena V, et al. Novel nonribosomal peptide synthetase (NRPS) genes sequenced from intertidal mudflat bacteria. FEMS Microbiol Lett 2014; 357(2): 123-30.
  18. Freschi L, Jeukens J, Kukavica-Ibrulj I, Boyle B, Dupont MJ, Laroche J, et al. Clinical utilization of genomics data produced by the international Pseudomonas aeruginosa consortium. Front Microbiol 2015; 6: 1036.
مجله دانشکده پزشکی اصفهان
دوره 34، شماره 388 - شماره پیاپی 388
مرداد و شهریور 1395
صفحه 730-736

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 21 بهمن 1394
  • تاریخ بازنگری: 06 اردیبهشت 1403
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار