کلونینگ و بیان آنتاگونیست گیرنده‌ی اینترلوکین 1 نوترکیب انسانی در سیستم‌های بیانی Escherichia coli شامل (DE3) Bl21، (DE3) Origami و (DE3) Rosetta

نوع مقاله : مقاله های پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده‌ی علوم و فناوری نوین، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 دانشیار، گروه واکسن هپاتیت ب نوترکیب، مجتمع تولیدی و تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران، ایران

3 استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده‌ی علوم و فناوری نوین، واحد علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: آنتاگونیست گیرنده‌ی اینترلوکین 1 (IL-1RA)، پروتئینی 153 آمینواسیدی (با وزن مولکولی 83/16 کیلودالتون) است. این پروتئین دارویی، با نام تجاری آناکینرا شناخته ‌شده است و کاربرد مؤثری در درمان آرتریت روماتوئید دارد. این مطالعه، به ‌منظور بررسی بیان پروتئین نوترکیب آنتاگونیست گیرنده‌ی اینترلوکین 1 در سویه‌های باکتری Escherichia coli (E. coli) انجام شد.روش‌ها: بهینه‌سازی ژن IL-1 RA با استفاده از GenScript انجام شد و در پلاسمید pUC18 به عنوان وکتور کلونینگ، قرار گرفت. سپس، این پلاسمید با دو آنزیم محدود کننده‌ی NdeI و BamHI برش خورد. ژن IL-1RA از روی ژل تخلیص شد. ژن IL-1RA به داخل وکتور بیانی وارد شد. سازه‌ی کاست بیانی به داخل باکتری‌های E. coli Origami، E. coli BL21 و E. coli Rosetta با روش کلرید کلسیم (CaCl2) و شوک حرارتی منتقل شد.یافته‌ها: تشخیص و تأیید کلنی‌های منتقل شده با Colony polymerase chain reaction (Colony PCR) انجام شد. القای این ژن با به کار گیری Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) انجام گرفت. بیان پروتئین با استفاده از روش‌‌های Western blotting و Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) تأیید شد و به وسیله‌ی رزین نیکل تخلیص گردید. آنالیز بیانی سوش‌های E. coli ترانسفورم شده تأیید کرد که ورود سازه به داخل وکتور بیانی انجام‌ شده است. وزن مولکولی پروتئین بیان‌ شده، 83/16کیلو دالتون برآورد شد.نتیجه‌گیری: در این مطالعه، آنتاگونیست گیرنده‌ی اینترلوکین 1 انسانی در باکتری E. coli Origami با مقادیر بالا نسبت به سویه‌های دیگر E. coli، به طور موفقیت‌آمیزی تولید شد. باکتری E. coli Origami می‌تواند به‌ عنوان میزبان مناسب در تولید IL-1RA نوترکیب انسانی مورد استفاده قرار گیرد و این فن‌آوری قابلیت بومی‌سازی دارد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Cloning and Expression of Recombinant Human Interleukin 1 Receptor Antagonist in Escherichia Coli Strains, BL21 (DE3), Rosetta (DE3), and Origami (DE3)

نویسندگان [English]

  • Hanieh Fardgoli 1
  • Seyed Nezameddin Hoseini 2
  • Setareh Haghighat 3
1 MSc Student, Department of Microbiology, School of Advanced Science and Technology, Tehran Medical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Associate Professor, Department of Recombinant Hepatitis B Vaccine, Production and Research Complex, Pasteur Institute of Iran, Iran
3 Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Advanced Science and Technology, Tehran Medical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Background: Recombinant human interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) is a protein with 153 amino acids and molecular weight of 16.83 kDa. This drug protein is known as Anakinra, and has an effective application in the treatment of rheumatoid arthritis. This study was conducted to examine the produce of the recombinant IL-1RA protein in Escherichia coli (E. coli) strains.Methods: Codon optimization of IL-1RA gene was done using GenScript, and the gene was cloned in the pUC18 as cloning vector. Then, plasmid was cut by two restriction enzymes including NdeI and BamH1 enzymes. IL-1RA gene was purified from the agarose gel. IL-1RA gene was ligated into expression vector. The constructed expression cassette was transformed into E. coli BL21 (DE3) Origami (DE3) and Rosetta (DE3) using CaCl2 and heat shock method.Findings: Identification and confirmation of transformed colonies was performed using colony polymerase chain reaction (PCR). Induction of this gene was done with isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The protein expression was analyzed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting techniques, and it purified by Ni nickel resin. Expression analysis of transformed E. coli strains confirmed that gene integrated into expression host. Molecular weight of expressed protein was estimated to be 16.83 kDa.Conclusion: In this study, Human IL-1RA was successfully produced in E. coli Origami with high quantity other than the rest of E. coli strains. Therefore, E. coli BL21 Origami (DE3) can be used as the suitable host for production of recombinant IL-1RA, and this technology has a potential for localization.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Interleukin 1 receptor antagonist protein
  • Recombination
  • Escherichia coli
  1. Wood DD, Ihrie EJ, Dinarello CA, Cohen PL. Isolation of an interleukin-1-like factor from human joint effusions. Arthritis Rheum 1983; 26(8): 975-83.
  2. Schulz MF, Buell G, Schmid E, Movva R, Selzer G. Increased expression in Escherichia coli of a synthetic gene encoding human somatomedin C after gene duplication and fusion. J Bacteriol 1987; 169(12): 5385-92.
  3. Carter DB, Deibel MR, Jr., Dunn CJ, Tomich CS, Laborde AL, Slightom JL, et al. Purification, cloning, expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. Nature 1990; 344(6267): 633-8.
  4. Perrier S, Darakhshan F, Hajduch E. IL-1 receptor antagonist in metabolic diseases: Dr Jekyll or Mr Hyde? FEBS Lett 2006; 580(27): 6289-94.
  5. Arend WP. Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: the role of interleukin-1 receptor antagonist. Semin Arthritis Rheum 2001; 30(5 Suppl 2): 1-6.
  6. Chen Z, Chen H, Wang X, Ma X, Huang B. Expression, purification, and characterization of secreted recombinant human insulin-like growth factor-binding protein-6 in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr Purif 2007; 52(2): 239-48.
  7. Kim SO, Lee YI. High-level expression and simple purification of recombinant human insulin-like growth factor I. J Biotechnol 1996; 48(1-2): 97-105.
  8. Khuzaima I, Iftikhar K, Tabarruk U, Sadia H, Akhtar H, Shami K. Studying the pharmacokinetics of interleukin-1RA mutants. BioScientific Review 2019; 1(1): 17-23.
  9. Brinkmann U, Mattes RE, Buckel P. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 1989; 85(1): 109-14.
  10. Al-Hejin A, Bora R, Ahmed M. Plasmids for optimizing expression of recombinant proteins in E. coli. In: Gull M, editor. Plasmid. London, UK: IntechOpen; 2019.
  11. Studier FW. Improved cloning and expression vectors and systems (WO2017139412A1) [Google Patents]. 2017.
  12. Miller MG, Chng C, Alvizo O, Mayo MA, Riggins JN, Yi X, et al. T7 rna polymerase variants. Redwood City, CA; US20190002851. 2019.
  13. Ranjbari J. Engineered recombinant protein production systems originated from Escherichia coli. Trends in Peptide and Protein Sciences 2018; 3: e2.
  14. Buryskova M, Pospisek M, Grothey A, Simmet T, Burysek L. Intracellular interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes. J Biol Chem 2004; 279(6): 4017-26.
  15. Wang YX, Yang ZX, Zhu HQ, Zhou XW, Huang PT. Construction, expression and preliminary pharmacokinetic analysis of IL-1ra mutants. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 2006; 22(3): 472-6. [In Chinese].
  16. Birikh KR, Lebedenko EN, Boni IV, Berlin YA. A high-level prokaryotic expression system: Synthesis of human interleukin 1 alpha and its receptor antagonist. Gene 1995; 164(2): 341-5.
  17. Zanette D, Dundon W, Soffientini A, Sottani C, Marinelli F, Akeson A, et al. Human IL-1 receptor antagonist from Escherichia coli: Large-scale microbial growth and protein purification. J Biotechnol 1998; 64(2-3): 187-96.
دوره 37، شماره 539 - شماره پیاپی 539
مهر و آبان 1398
صفحه 965-972
  • تاریخ دریافت: 12 شهریور 1398
  • تاریخ بازنگری: 05 فروردین 1402
  • تاریخ پذیرش: 17 فروردین 1401
  • تاریخ اولین انتشار: 17 فروردین 1401